【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶工程，涉及一种双功能谷胱甘肽合成酶的高催化活性突变体的设计与筛选方法，以及一系列双功能谷胱甘肽合成酶突变体及其应用。
技术介绍
1、谷胱甘肽(γ-l-谷氨酰-l-半胱氨酰甘氨酸，glutathione)是普遍存在于生物体内的巯基三肽化合物，具有维持细胞内氧化还原平衡的功能。由于其重要的生理功能，谷胱甘肽被广泛应用于多种领域。目前，谷胱甘肽在国内被用于药品、保健食品、化妆品和生物肥料，并正在申报新饲料添加剂。谷胱甘肽的下游需求结构占比分别为医药65％、保健食品和化妆品30％、农业5％。预计2022年谷胱甘肽的总需求为740～850吨。因其具有重要的应用前景，谷胱甘肽的工业化生产日益受到关注。
2、当前，国内外生产谷胱甘肽的方法主要有化学合成法、微生物发酵法和酶催化法。化学合成的谷胱甘肽是l-型(活性)和d-型(非活性)的消旋体，需要后续的光学拆分。此外，化工产品固有的安全性问题也严重制约其在药品、食品领域的应用。目前，国内外主流的工艺利用酵母的诱变株或基因工程株发酵生产谷胱甘肽，但发酵法存在周期长、发酵液组分复杂(如色素等杂质)、分离纯化繁琐等弊端。酶催化法具有更高的生产效率、反应体系相对纯净，近年来取得长足发展，大有取代发酵法的趋势。
3、谷胱甘肽的生物合成依靠两种单一功能的酶(γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶)或一种双功能的酶(双功能谷胱甘肽合成酶，gshab或gshf)。后者的发现和应用，简化了酶的制备，克服了前者双酶系统的产物抑制问题，效率更高，因而日益受到重视。然而，野生型
技术实现思路
1、鉴于现有技术的不足，本专利技术提供了一种双功能谷胱甘肽合成酶的高活性突变体的设计与筛选方法，以解决筛选突变体存在很大随机性、筛选数量庞大、效率低下等问题，并将高催化活性突变体应用于谷胱甘肽的合成，以提高产率、降低生产成本。本专利技术很大程度降低了突变体文库的筛选工作量(设计94个突变体)，大幅提高了高活性突变体的命中率(12.8％，12个活力提高的突变)。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术第一方面提供一种双功能谷胱甘肽合成酶的高活性突变体的设计与筛选方法，包括以下步骤：
3、(1)进行野生型酶的蛋白质3d结构的从头预测；或从蛋白质结构数据库中检索与野生型酶的氨基酸序列一致性超过30％的蛋白质，选择同源性最高的蛋白质的3d结构为模板进行野生型酶结构的比较建模；获得一个或多个3d模型；所述野生型酶为天然的双功能谷胱甘肽合成酶。
4、步骤(1)绕开了酶蛋白三维结构解析所需的耗时、繁琐、技术要求很高的x-射线晶体衍射、冷冻电镜或者核磁共振技术，利用计算生物学工具可直接短时间内获得预测的结构模型。
5、(2)分别对配体分子和野生型酶的3d模型进行结构准备，将配体分子对接至酶催化中心的结合口袋；所述配体分子包括底物、中间体或产物。
6、上述底物为glu、上述中间体为四面体过渡态反应中间体(pi-γ-glu-cys，图4)和上述产物为谷胱甘肽。
7、步骤(2)将各种配体分子对接至步骤(1)中所获3d模型的活性中心，规避了实验难度很高的蛋白质-小分子共结晶，便于后续分析突变体-配体复合物，有利于寻找酶-底物、酶-过渡态反应中间体亲和力提高，或者酶-产物亲和力降低的突变体。
8、(3)对野生型酶的全部氨基酸残基进行虚拟丙氨酸扫描，选定对配体分子的亲和力影响较大的氨基酸位点；对所述氨基酸位点进行残基扫描，遴选底物、中间体的亲和力预测值增加，或产物的亲和力减弱的突变体。
9、步骤(3)可以在几天内模拟cfgshab的饱和突变，757个氨基酸位点共计14383种单点突变形式，人力构建如此规模的突变体文库的耗时以年来计算，而且步骤(3)所使用的计算机能够量化步骤(2)所获酶的蛋白与配体分子的复合物亲和力的变化，无需全部依靠实验测定，只需人为实验验证经过计算机虚拟筛选出来的不足100个突变体，工作量缩减140多倍。
10、(4)构建配体亲和力变化符合步骤(3)预期的各突变体的表达载体，并进行n-端融合标签介导的突变体的表面展示表达。
11、上述表达载体构成的表达盒元件的组织形式为pt7-his6-sfgfp-cfgshabmut-tt7，从5’端至3’端依次为t7启动子、6个组氨酸标签、超折叠绿色荧光蛋白、突变体、t7终止子的编码dna。所述超折叠绿色荧光蛋白的登录号为pdb id:2b3p，所述cfgshab酶的登录号为genbank id:wp_100288369.1。
12、步骤(4)利用经过改造的n-端超折叠绿色荧光蛋白，可介导其c-端融合的目标酶蛋白跨越大肠杆菌外膜，步骤(3)虚拟筛选出来的酶蛋白展示于菌体胞外可直接催化外源添加的底物转化为产物，避免了常规胞内表达的酶蛋白难以接触外界底物以及产物释放至胞外的困难(底物和产物跨膜的困难)，便于高通量筛选。
13、(5)进行所述的突变体催化的谷胱甘肽合成反应，利用反应产物偶联的显色反应筛选吸光度/菌液浓度比值大于野生型酶的突变体。
14、步骤(5)生物催化合成谷胱甘肽的反应本身并无明显的外观变化，需要巧妙设计产物的偶联反应将步骤(4)的酶促反应可视化，并能通过检测光电信号实现高通量的筛选。
15、以上步骤(1)-(5)进行组合，能充分利用计算生物学手段实现解放人力、提高筛选通量、提升高活力突变体的命中率。
16、在某些实施例中，
17、步骤(1)中，所述野生型酶为源于浅黄保守杆菌(c.flavescens)的双功能谷胱甘肽合成酶，优选地，所述野生型酶的氨基酸序列如seq id no:1所示；和/或，
18、基于离散优化蛋白能量的模型评价，选择得分最低的模型用于loop优化，进一步降低能量。
19、在某些实施例中，
20、步骤(1)中，所述的蛋白质3d结构的建模工具包括alphafold2、i-tasser、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种双功能谷胱甘肽合成酶的高活性突变体的设计与筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的设计与筛选方法，其特征在于，
3.如权利要求1所述的设计与筛选方法，其特征在于，
4.一种双功能谷胱甘肽合成酶的突变体，其特征在于，所述突变体与野生型酶相比，在第129位、第83位、第137位、第138位、第140-144位、第262位、第356位和/或第455位的氨基酸进行替换；所述野生型酶为源于浅黄保守杆菌(C.flavescens)的双功能谷胱甘肽合成酶，优选地，所述野生型酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.如权利要求4所述的突变体，其特征在于，与野生型酶相比，包含如下氨基酸残基差异中的一种或多种：
6.如权利要求4所述的突变体，其特征在于，与野生型酶相比，包含如下氨基酸残基差异组合：
7.如权利要求4-6任一项所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQID NO:3、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SE
8.一种制备谷胱甘肽的方法，其特征在于，在培养基中培养如权利要求4-7任一项所述的突变体；优选地，所述培养基为LB培养基。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，
10.一种如权利要求4-7任一项所述的突变体在谷胱甘肽合成中的应用，其特征在于，利用所述突变体，以L-谷氨酸(钠)、L-半胱氨酸、甘氨酸为底物，聚磷酸激酶和六偏磷酸盐PolyP(6)作为ATP再生系统，镁离子为辅基，控制反应温度维持在30-37℃，pH范围维持在7.5-8.5，催化合成还原型谷胱甘肽。
...【技术特征摘要】
1.一种双功能谷胱甘肽合成酶的高活性突变体的设计与筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的设计与筛选方法，其特征在于，
3.如权利要求1所述的设计与筛选方法，其特征在于，
4.一种双功能谷胱甘肽合成酶的突变体，其特征在于，所述突变体与野生型酶相比，在第129位、第83位、第137位、第138位、第140-144位、第262位、第356位和/或第455位的氨基酸进行替换；所述野生型酶为源于浅黄保守杆菌(c.flavescens)的双功能谷胱甘肽合成酶，优选地，所述野生型酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。
5.如权利要求4所述的突变体，其特征在于，与野生型酶相比，包含如下氨基酸残基差异中的一种或多种：
6.如权利要求4所述的突变体，其特征在于，与野生型酶相比，包含如下氨基酸残基差异组合：
7.如权利要求4-6任一项所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如seqid no...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘超，杨琥，高榕，
申请(专利权)人：武汉启瑞药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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