一种(+)γ-内酰胺酶转化拆分制备(-)γ-内酰胺的方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，公开了一种(+)γ

【技术实现步骤摘要】
一种(+)
γ
‑
内酰胺酶转化拆分制备(
‑
)
γ
‑
内酰胺的方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，本专利技术涉及一种(+)γ
‑
内酰胺酶转化拆分制备(
‑
)γ
‑
内酰胺的方法。

技术介绍

[0002]γ
‑
内酰胺酶是γ
‑
内酰胺酶是催化酰胺类化合物γ
‑
内酰胺酰胺键的一种新型酰胺酶，由于其能选择性降解工业上的(
±
)γ
‑
内酰胺，因而被命名为γ
‑
内酰胺酶。(
±
)γ
‑
内酰胺包含(
±
)两种旋光构型：(+)γ
‑
内酰胺以及(
‑
)γ
‑
内酰胺。光学纯的(
‑
)γ
‑
内酰胺是制备抗病毒药物的手性中间体，是抗艾滋病药物(
‑
)阿巴卡韦和(
‑
)卡巴韦的合成原料，也是抗流感药物帕拉米韦的合成原料。(+)γ
‑
内酰胺酶能够高效率动力学拆分外消旋体γ
‑
内酰胺，获得光学纯的(
‑
)γ
‑
内酰胺。
[0003]临床上已知阿巴卡韦的药理活性来源于(
‑
)阿巴卡韦，因此(
‑
)阿巴卡韦的合成原料(<br/>‑
)γ
‑
内酰胺的高效制备具有重要临床意义。目前制备单构型γ
‑
内酰胺的方法有不对称合成法和循环优先结晶法，但是这两种方法存在成本高、产率低、纯度低等局限性，因此开发新的(
‑
)γ
‑
内酰胺制备方法能为合成单一构型的药物奠定坚实临床基础，具有广阔的应用前景与经济效益。

技术实现思路

[0004]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种利用(+)γ
‑
内酰胺酶转化拆分制备(
‑
)γ
‑
内酰胺的方法。该方法主要是利用从海泥中筛选特定菌株，通过调控反应体系中的理化因素，利用筛选得到的特定产γ
‑
内酰胺酶菌株高立体选择性降解(+)γ
‑
内酰胺，从而得到光学纯的(
‑
)γ
‑
内酰胺，进而能高效安全的生产(
‑
)γ
‑
内酰胺产品。这种生物不对称拆分法具有反应条件温和、效率高、环境友好等优点。
[0005]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案实现的：
[0006]一种(+)γ
‑
内酰胺酶转化拆分制备(
‑
)γ
‑
内酰胺的方法，具体包括以下步骤：
[0007]步骤一.微生物发酵产(+)γ
‑
内酰胺酶
[0008]选产(+)γ
‑
内酰胺酶的菌株作为种子，接种于种子培养基，在22℃～30℃、120～180r/min条件下培养1d获得种子液。再以体积分数1.0％～3.0％接种量接入装有产酶发酵培养基的发酵罐，装液量15vt％～35vt％、培养温度25℃～32℃、转速为120～180rpm、通气量1vvm～3vvm、初始pH5.0～9.0、培养20～60h后收集发酵液。
[0009]步骤二.粗酶液样品制备
[0010]将步骤一中获得的发酵液低温高速离心，分离并收集菌体，得到的湿菌体经磷酸钠缓冲液(0.05mol/L，pH7.0)洗涤3次，将菌体悬于磷酸钠缓冲液中(0.05mol/L，pH7.0)，进行细胞破碎，破碎后10000rpm离心，取上清液为粗酶液，低温储存，备用。
[0011]步骤三.酶液浓缩
[0012]将步骤二中所得的(+)γ
‑
内酰胺酶粗酶液，低温透析浓缩得到浓缩酶液，浓缩时
使用10kD离心超滤管，测定浓缩酶液酶活、计算(+)γ
‑
内酰胺酶回收率。
[0013]步骤四.生产(
‑
)γ
‑
内酰胺
[0014]利用步骤三中获得的浓缩酶液转化(
±
)γ
‑
内酰胺。其中，转化体系的温度为24℃～35℃，搅拌速度为180～220rpm，转化24～60h，得到的(
‑
)γ
‑
内酰胺产物用手性HPLC分析浓度。
[0015]优选地，步骤一中所述种子培养基为酵母浸粉0.3～0.8％，葡萄糖0.3～0.8wt％，KH2PO40.4～0.9wt％，Na2HPO
4 0.1～0.5wt％，MgSO
4 0.02～0.06wt％，FeSO
4 0.001～0.003wt％，CaCl
2 0.001～0.003wt％，NH4Cl 0.3～0.8wt％，调节pH7.0。所述发酵培养基为葡萄糖0.3～0.8wt％，蛋白胨0.8～1.5wt％，Tween
‑
80 0.05～0.2wt％，KH2PO
4 0.5～1.0wt％，Na2HPO40.1～0.3wt％，Mg2SO
4 0.02～0.06wt％，调节pH7.5；
[0016]优选地，所述的产(+)γ
‑
内酰胺酶的菌株为Bacillus thuringiensis sp.BH24；网站:http://www.cgmcc.net/(中国普通微生物菌种保藏管理中心)登记号:NR 114581
[0017]该菌株于辽宁省大连市渤海海泥环境中筛选得到。取渤海海泥2.0g加入无菌生理盐水混匀制成样品，在25℃～30℃条件下进行富集培养，采用平板划线分离法，将富集培养后得到的菌株进一步纯化得到单菌落，以N
‑
乙酰
‑
L苯丙氨酸为唯一碳源进行初筛，将初筛获得的菌株接种于初始发酵培养基，25℃～32℃、120～180r/min条件下培养24h，然后离心洗涤，将洗涤后的菌体悬浮于质量浓度为10g/L的N
‑
乙酰
‑
L
‑
苯丙氨酸的磷酸盐缓冲液中，在25℃～32℃、120～180r/min条件下反应，10h后取样，手性HPLC分析检测转化后样品中(
±
)γ
‑
内酰胺成分的变化，复筛得到具有较高(+)γ
‑
内酰胺酶活性的菌株Bacillus thuringiensis sp.BH24；
[0018]优选地，步骤二中低温高速离心为4℃、12000rpm离心；
[0019]优选地，步骤三中浓缩温度为4℃，10000r/min离心30min；
[0020]酶活测定方法：将洗涤后的菌体悬浮于浓度为10g/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种(+)γ
‑
内酰胺酶转化拆分制备(
‑
)γ
‑
内酰胺的方法，其特征是，包括以下步骤：步骤一.微生物发酵产(+)γ
‑
内酰胺酶选产(+)γ
‑
内酰胺酶的菌株作为种子，接种于种子培养基，在22℃～30℃、120～180r/min条件下培养1d获得种子液；再以体积分数1.0vt％～3.0vt％接种量接入装有产酶发酵培养基的发酵罐，装液量15％～35％、培养温度25℃～32℃、转速为120～180rpm、通气量1vvm～3vvm、初始pH5.0～9.0、培养20～60h后收集发酵液；步骤二.粗酶液样品制备将步骤一中获得的发酵液低温高速离心，分离并收集菌体，得到的湿菌体经磷酸钠缓冲液洗涤3次，将菌体悬于磷酸钠缓冲液中，进行细胞破碎，破碎后10000rpm离心，取上清液为粗酶液，低温储存，备用；步骤三.酶液浓缩将步骤二中所得的(+)γ
‑
内酰胺酶粗酶液，低温透析浓缩得到浓缩酶液，浓缩时使用10kD离心超滤管，测定浓缩酶液酶活、计算(+)γ
‑
内酰胺酶回收率；步骤四.生产(
‑
)γ
‑
内酰胺利用步骤三中获得的浓缩酶液转化(
±
)γ
‑
内酰胺；其中，转化体系的温度为24℃～35℃，搅拌速度为180～220rpm，转化24～60h，得到的(
‑
)γ
‑
内酰胺产物用手性HPLC分析浓度。2.如权利要求1所述的一种(+)γ
‑
内酰胺酶转化拆分制备(
‑
)γ
‑
内酰胺的方法，其特征是，所述的产(+)γ
...

【专利技术属性】
技术研发人员：于爽，王聪，袁文涛，迟雪梅，张庆芳，刘春莹，王严，夏水英，郭洪志，迟乃玉，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：