一种分离提纯（-）γ-内酰胺的方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，公开了一种分离提纯(

【技术实现步骤摘要】
一种分离提纯(
‑
)
γ
‑
内酰胺的方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，本专利技术涉及一种分离提纯(
‑
)γ
‑
内酰胺的方法。

技术介绍

[0002]γ
‑
内酰胺酶属于酰胺酶的一种，是催化酰胺类化合物γ
‑
内酰胺酰胺键的一种新型酰胺酶，由于其能选择性降解工业上的(
±
)γ
‑
内酰胺，因而被命名为γ
‑
内酰胺酶。γ
‑
内酰胺酶包括(+)γ
‑
内酰胺酶以及(
‑
)γ
‑
内酰胺酶，其中(+)γ
‑
内酰胺酶能够高效率动力学拆分外消旋体γ
‑
内酰胺，获得光学纯的(
‑
)γ
‑
内酰胺。光学纯的(
‑
)γ
‑
内酰胺是制备抗病毒药物的手性中间体，是抗艾滋病药物(
‑
)阿巴卡韦和(
‑
)卡巴韦的合成原料，也是抗流感药物帕拉米韦的合成原料。
[0003]临床上已知阿巴卡韦的药理活性来源于(
‑
)阿巴卡韦，因而科学工作者们的目光都锁定在了挖掘(+)γ
‑
内酰胺酶上，试图利用(+)γ
‑
内酰胺酶拆分(
±
)γ
‑
内酰胺，得到的(
‑
)γ
‑
内酰胺，再进行分离提纯，以满足生产需要。

技术实现思路

[0004]为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种分离提纯(
‑
)γ
‑
内酰胺的方法，该方法主要是利用从海泥中筛选产酶菌株，通过调控反应体系中的理化因素，利用筛选得到的产(+)γ
‑
内酰胺酶菌株高立体选择性降解(
±
)γ
‑
内酰胺中的(+)γ
‑
内酰胺，得到光学纯的(
‑
)γ
‑
内酰胺，进而对(
‑
)γ
‑
内酰胺进行分离提纯。运用生物酶法进行工业化生产(
‑
)γ
‑
内酰胺，具有反应条件温和，产物光学纯度高，环境友好等优点。
[0005]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案实现的：
[0006]一种分离提纯(
‑
)γ
‑
内酰胺的方法，具体包括以下步骤：
[0007](1)微生物发酵产(+)γ
‑
内酰胺酶；
[0008](2)酶液样品制备与浓缩；
[0009](3)固定化酶制备；
[0010](4)生产(
‑
)γ
‑
内酰胺；
[0011](5)分离提纯(
‑
)γ
‑
内酰胺。
[0012]本专利技术与现有技术相比的有益效果是：
[0013]本专利技术提供一种分离提纯(
‑
)γ
‑
内酰胺的方法，该方法主要是利用从海泥中筛选产酶菌株，通过调控反应体系中的理化因素，利用筛选得到的产(+)γ
‑
内酰胺酶菌株高立体选择性降解(
±
)γ
‑
内酰胺中的(+)γ
‑
内酰胺，得到光学纯的(
‑
)γ
‑
内酰胺，进而对(
‑
)γ
‑
内酰胺进行分离提纯。运用生物酶法进行工业化生产(
‑
)γ
‑
内酰胺，具有反应条件温和，产物光学纯度高，环境友好等优点。本专利技术对(
‑
)γ
‑
内酰胺进行分离提纯，纯度达到95.62％。
附图说明
[0014]图1是(
±
)γ
‑
内酰胺的转化进程。
具体实施方式
[0015]下面通过具体实施例详述本专利技术，但不限制本专利技术的保护范围。如无特殊说明，本专利技术所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
[0016]实施例1
[0017](1)微生物发酵产(+)γ
‑
内酰胺酶
[0018]选择菌株BH24作为种子，在20～28℃、150～220r/min条件下培养1d获得得种子液。再以体积分数1.0％～3.0％接种量接入装有产酶发酵培养基的发酵罐，装液量20％～35％、培养温度25℃～30℃、转速为150～180r/min、通气量1vvm～3vvm、初始pH5.0～8.0、培养30h～50h后收集发酵液；
[0019]产酶发酵培养基：葡萄糖5.0g/L，酵母膏5.0g/L，KH2PO
4 7.0g/L，Na2HPO
4 2.0g/L，MgSO
4 0.4g/L，FeSO40.02 g/L，CaCl
2 0.02g/L，NH4Cl 5.0g/L，调节pH7.0。
[0020](2)酶液样品制备与浓缩
[0021]将步骤(1)中获得的发酵液低温4℃高速离心，分离并收集菌体，得到的湿菌体经磷酸钠缓冲液(0.05mol/L，pH7.0)洗涤3
‑
5次，将菌体悬于磷酸钠缓冲液中(0.05mol/L，pH7.0)，进行细胞破碎，破碎后12000r/min离心，取上清液为粗酶液，低温储存，备用，将所得的(+)γ
‑
内酰胺酶粗酶液，低温透析浓缩得到浓缩酶液，测定浓缩酶液酶活、计算(+)γ
‑
内酰胺酶回收率；
[0022](3)固定化酶制备
[0023]采用戊二醛交联方法，在25℃下交联化，摇床转速为200～250r/min，戊二醛浓度为3％～5wt％，戊二醛溶液与树脂质量比为4：1，交联结束后用去离子水清洗未参加反应的戊二醛分子，防止与酶固定化时发生酶中毒。交联好后的树脂按照树脂1g：25mL酶液进行固定化，一般的条件为：摇床转速220r/min，温度25℃，固定化时间8h，固定化结束后用滤布将满载酶的树脂分离，得到的固定化酶用去离子水清洗三遍去除表面附着的酶；
[0024](4)生产(
‑
)γ
‑
内酰胺
[0025]利用步骤(3)中获得的固定化酶无菌转化(
±
)γ
‑
内酰胺；其中，转化体系的温度为20℃～30℃，搅拌速度为200～250r/min，转化20～50h，得到的(
‑
)γ
‑
内酰胺产物用手性HPLC分析(
‑
)γ
‑
内酰胺的浓度；
[0026](5)分离提纯(
‑
)γ
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分离提纯(
‑
)γ
‑
内酰胺的方法，其特征是，通过菌株BH24发酵生产的产(+)γ
‑
内酰胺酶，制备固定化酶，利用固定化酶无菌转化(
±
)γ
‑
内酰胺，对产物(
‑
)γ
‑
内酰胺进行分离提纯。2.如权利要求1所述的菌株BH24登记于中国普通微生物菌种保藏管理中心，登记号：NR114581。3.如权利要求1所述的菌株BH24筛选于渤海海泥，...

【专利技术属性】
技术研发人员：迟雪梅，袁文涛，王聪，于爽，张庆芳，刘春莹，夏水英，王严，郭信志，迟乃玉，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：