一种吡咯烷酮的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种吡咯烷酮的制备方法，本发明专利技术提供一种利用肉碱辅酶A连接酶CaiC催化γ

【技术实现步骤摘要】
一种吡咯烷酮的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种吡咯烷酮的制备方法，属于生物工程


技术介绍

[0002]吡咯烷酮又称丁内酰胺、α
‑
吡咯烷酮，是一种无色结晶，可用作溶剂及有机合成中间体，以及用来制造尼龙4和乙烯基吡咯烷酮等多种化合物的前体，在工业上具有许多重要的应用。吡咯烷酮及其衍生物作为五元氮杂环分子，在生物活性方面具有某些独特的性质，许多天然产物中都有此类杂环化合物的分子骨架存在。
[0003]目前吡咯烷酮的合成以化学法为主，由γ
‑
丁内酯与氨气在高温、高压下反应，以94％的收率得到目标产物。但是化学法虽然得率高，能耗却较大，同时会对环境产生毒害作用，不符合绿色生产、安全生产和可持续发展的要求。相对传统的化学法，通过生物法制备吡咯烷酮具有产品质量稳定安全、工艺条件温和、环保等特点，可以减轻环境和资源压力，因此迫切需要一种有效的生物法高效制备吡咯烷酮。
[0004]近几年国内外对吡咯烷酮的生物法合成进行了一些研究，目前生物法合成吡咯烷酮主要采用微生物发酵法和酶转化法。但是微生物发酵法，发酵周期比较长，生产强度低，并不适用于工业生产。而现有的酶转化法催化效率低、产量极低，因此迫切需要一种有效的酶转化法高效制备吡咯烷酮。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种吡咯烷酮的制备方法，本专利技术具体是提供一种利用肉碱辅酶A连接酶CaiC催化γ
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氨基丁酸制备吡咯烷酮的方法，或利用该肉碱辅酶A连接酶CaiC构建重组菌，进行全细胞法转化γ
‑
氨基丁酸生产吡咯烷酮的方法，具有低环境损害、生产周期短、减少了转化中的副产物等优点，极大提高了工业化的生产效率。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种吡咯烷酮的制备方法，所述方法是以肉碱辅酶A连接酶CaiC或表达肉碱辅酶A连接酶CaiC的全细胞为催化剂，催化γ
‑
氨基丁酸制备吡咯烷酮。
[0007]进一步地，所述的肉碱辅酶A连接酶CaiC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]进一步地，所述的肉碱辅酶A连接酶CaiC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]进一步地，所述的全细胞是将表达肉碱辅酶A连接酶CaiC的重组菌株经过IPTG诱导12
‑
16h后收集得到。
[0010]进一步地，所述的重组菌株是以大肠杆菌为宿主，以PET
‑
28a为表达载体表达肉碱辅酶A连接酶CaiC。
[0011]进一步地，所述的大肠杆菌为Escherichia coli BL21(DE3)。
[0012]进一步地，催化反应的反应体系中含有γ
‑
氨基丁酸、ATP和Mg
2+
。
[0013]进一步地，所述的反应体系中，全细胞的终浓度为15～25g/L。
[0014]进一步地，所述的反应体系中，γ
‑
氨基丁酸的终浓度为5～15g/L。
[0015]进一步地，所述的反应体系中，含有40～60mM ATP以及20～40mM Mg
2+
。
[0016]进一步地，反应体系的pH为7.4
‑
7.6，反应温度为35～38℃。
[0017]本专利技术的有益效果是：
[0018]本专利技术提供一种利用肉碱辅酶A连接酶CaiC催化γ
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氨基丁酸制备吡咯烷酮的方法。所述肉碱辅酶A连接酶CaiC的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。该连接酶具有催化γ
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氨基丁酸环化生成吡咯烷酮的活性。本专利技术提供的肉碱辅酶A连接酶以γ
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氨基丁酸为底物时24h吡咯烷酮的产量为3.26g/L，摩尔产率可达39.53％，减少了生产周期，提高了吡咯烷酮的产量，加快了酶转化法生产吡咯烷酮的工业化进程。
附图说明
[0019]图1为本专利技术肉碱辅酶A连接酶CaiC诱导表达的SDS
‑
PAGE图；泳道M是指低分子量蛋白Marker；泳道1～3分别是25℃下0.2mM IPTG浓度诱导表达后上清液、沉淀和全细胞中所目的蛋白条带大小。
[0020]图2为酶活性验证图，对转化体系内各组分进行缺失对照，对比吡咯烷酮的生成情况图。
[0021]图3为转化缓冲液pH和吡咯烷酮生产量的关系图。
[0022]图4为Mg
2+
浓度和吡咯烷酮生产量的关系图。
[0023]图5为转化温度和吡咯烷酮生产量的关系图。
[0024]图6为底物浓度和吡咯烷酮生产量的关系图。
具体实施方式
[0025]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。
[0026]下述实施例中所涉及的pET
‑
28a(+)质粒购自Novagen(Madison,WI,U.S.A.)，限制性内切酶、primeSTAR、同源重组酶等购自TaKaRa(Dalian,China)。标品γ
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氨基丁酸、吡咯烷酮均购自美国Sigma
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Aldrich公司，其余试剂均为市场购买所得。
[0027]下述实施例中所涉及的培养基如下：
[0028]LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，在121℃灭菌20min。
[0029]LB固体培养基：在LB液体培养基基础上，添加2％的琼脂。
[0030]TB液体培养基：KH2PO
4 2.31g/L，K2HPO4·
3H2O 16.42g/L，酵母粉24g/L，蛋白胨12g/L，甘油4g/L。
[0031]实施例1：肉碱辅酶A连接酶CaiC的表达与纯化
[0032]基因工程菌的构建及蛋白的表达：
[0033]以大肠杆菌Escherichia coli(strain K12)中目的蛋白编码基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.2所示)为模板，利用F1和R1为引物(下划线分别是EcoR I和HindⅢ限制性酶切位点)PCR扩增，扩增条件为：
[0034]95℃5min，29个循环(98℃10s，55℃15s，72℃1.5min)，72℃5min。
[0035]F1：agcaaatgggtcgcggatccgaattcATGGATATCATTGGCGGACAACATCTAC(SEQ ID NO.3)；
[0036]R1：tggtgctcgagtgcggccgcaagcttTTTCAGATTCTTTCTAATTATTTTCCCCGAGCAAT(SEQ ID NO.4)。
[0037]获得肉碱辅酶A连接酶CaiC基因编码区cDNA序列，PCR产物回收后与经同样双酶切的pET
‑
28a(+)质粒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种吡咯烷酮的制备方法，其特征在于，所述方法是以肉碱辅酶A连接酶CaiC或表达肉碱辅酶A连接酶CaiC的全细胞为催化剂，催化γ
‑
氨基丁酸制备吡咯烷酮。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的肉碱辅酶A连接酶CaiC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的肉碱辅酶A连接酶CaiC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的全细胞是将表达肉碱辅酶A连接酶CaiC的重组菌株经过IPTG诱导12
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16h后收集得到。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的重组菌株是以大肠杆菌为宿主，以PET
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28a为表达载体表达肉碱辅酶A连接酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴静，姜旭玲，刘立明，宋伟，周怡雯，陈修来，刘佳，高聪，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：