一种光学纯(+)γ-内酰胺的制备工艺制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，公开了一种光学纯(+)γ

【技术实现步骤摘要】
一种光学纯(+)
γ
‑
内酰胺的制备工艺


[0001]本专利技术属于生物工程
，本专利技术涉及一种光学纯(+)γ
‑
内酰胺的制备工艺。具体涉及利用海泥中筛选的产γ
‑
内酰胺酶菌株进行选择性拆分，制备光学纯(+)γ
‑
内酰胺的方法。

技术介绍

[0002]γ
‑
内酰胺酶是酰胺酶的一种，是催化酰胺类化合物γ
‑
内酰胺酰胺键的一种新型酰胺酶，但γ
‑
内酰胺自身却是外消旋体，包含(
±
)两种旋光构型：(+)γ
‑
内酰胺以及(
‑
)γ
‑
内酰胺，(+)γ
‑
内酰胺可以作为中间体合成药物，如治疗艾滋病的阿巴卡韦以及治疗甲型流感的帕拉米韦，在工业应用中具有很大的潜力，市场需求巨大。但是利用外消旋体原料进行药物合成存在弊端，会致使由其合成的药物也带有手性，而手性药物存在不同对映体具有不同药理活性的潜在危害。
[0003]利用手性化合物的不对称合成是目前制备光学纯(+)γ
‑
内酰胺的主要方法之一，但由于其过程通常较为复杂，成本很高，并且具有局限性。

技术实现思路

[0004]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种制备光学纯(+)γ
‑
内酰胺，选择一株产γ
‑
内酰胺酶的菌株，通过高效液相色谱法检测菌株对γ
‑r/>内酰胺的降解情况，利用菌株进行5L发酵、底物拆分、产物回收生产安全、无毒的光学纯(+)γ
‑
内酰胺。
[0005]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案实现的：
[0006]一种制备光学纯(+)γ
‑
内酰胺的方法，包括以下步骤：
[0007]步骤一 发酵罐培养基制备；
[0008]按5L的发酵体积准备LB培养基，将培养基粉末加入5L发酵罐，加水至4.5L(灭菌过程中水位会上涨)，开蒸汽进夹套阀门使罐温升至100℃，开蒸汽进罐体阀门使罐体温度维持在121℃，灭菌30min。关闭蒸汽进夹套阀门、蒸汽进罐体阀门，通空气吹干空气滤芯，通空气进罐体降温，开恒温水泵使温度下降到设定温度37℃。
[0009]步骤二：接种；
[0010]按3％接种量接种产(+)γ
‑
内酰胺酶菌株，待菌液OD
600
值达到0.6
‑
0.8时，加入终浓度5g/L的乳糖。37℃继续培养6h后8000r/min离心30min收获菌体，加入含有50g/L(
±
)γ
‑
内酰胺的1L反应罐，反应过夜。
[0011]步骤三：产物回收；
[0012]翌日将反应液离心，上清用500mL正丁醇萃取，使用旋转蒸发仪干燥，再将干燥产物溶于少量水，利用冷冻干燥机冻干。
[0013]步骤四：选择性拆分及HPLC检测；
[0014]取步骤二的发酵菌液2mL，8000r/min离心5min留沉淀，加10g/L的(
±
)γ
‑
内酰胺溶液1.5mL。充分混匀，25℃摇床反应1h。或者取超声破碎上清2mL，加入0.5mL50g/L的(
±
)
γ
‑
内酰胺溶液，充分混匀，25℃摇床反应1h。而后将反应液8000r/min离心5min，取上清0.75mL，加等体积正丁醇反复颠倒混匀数次，8000r/min离心5min，注射器吸取上层，经有机滤膜过滤制备上样品。使用高效液相色谱进行底物降解情况检测，采用AS
‑
H手性色谱柱。
[0015]优选地，所述的产(+)γ
‑
内酰胺酶的菌株为Bacillus thuringiensis sp.BH24；由渤海海泥中筛选得到。网站:http://www.cgmcc.net/(中国普通微生物菌种保藏管理中心)登记号:NR114581。
[0016]菌株初筛
[0017]取渤海海域海水、海泥样品共20份，海水5m L，海泥各取2.0g左右加入10m L无菌生理盐水，充分混匀，取上清接进行富集培养基，按5％的接种量转入相同富集培养基中再培养2d。采用平板划线分离法，涂布在平板筛选培养基上，28℃培养。后挑取单菌落进行进一步纯化，并将纯化后的菌株进行斜面保藏，用于进一步活性测定。然后将离心获得的湿菌经0.05mol/L，p H 7.0的磷酸盐缓冲溶液洗涤3次以上，直至发酵液洗净为止，将洗涤后的菌体悬浮于质量浓度为10g/L的N
‑
乙酰
‑
L
‑
苯丙氨酸的上述磷酸盐缓冲液中。在28℃、150r/min条件下反应8h，8 000r/min离心10min，取上清液，用茚三酮比色法测定氨基酸的方法测定转化率。将能转化N
‑
乙酰
‑
L
‑
苯丙氨酸的32菌株进行保藏待用。
[0018]菌株复筛
[0019]将初筛获得的菌株接入种子培养基中在28℃、150r/min培养24h，按5％的接种量转入相同种子培养基中，28℃、150r/min培养24h，按5％的接种量接种于初始发酵培养基，28℃、150r/min培养24h。然后将离心获得的湿菌经0.05mol/L，p H 7.0的磷酸盐缓冲溶液洗涤3次以上，直至发酵液洗净为止，将洗涤后的菌体悬浮于质量浓度为10g/L的N
‑
乙酰
‑
L
‑
苯丙氨酸的上述磷酸盐缓冲液中。在28℃、150r/min条件下反应，在10h后取样，手性HPLC分析检测转化后样品中(
±
)γ
‑
内酰胺成分的变化，将具有较高(+)γ
‑
内酰胺酶活性的菌株保藏待用。
[0020]最后通过形态学、生理生化及16S r DNA序列测定，测序结果在GenBank中进行BLAST比对分析，菌株BH24鉴定为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)
[0021]优选地，步骤一中所述LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母浸粉5.0，NaCl 10.0，调节pH 7.2。
[0022]优选地，步骤二和步骤四所述种子培养基(g/L)为：酵母浸粉5.0，葡萄糖5.0，KH2PO47.0，NaHPO
4 2.0，MgSO
4 0.4，FeSO4 0.02，CaCl20.02，NH4Cl 5.0，调节pH 7.0。
[0023]优选地，步骤三中所述的离心条件为8000r/min，30min。
[0024]优选地，步骤四中所述的HPLC的流动相为乙腈异丙醇9：1(体积比)，总流速为0.6mL/min，230nm波长检测，待基线平上样10μL。
[0025]本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种光学纯(+)γ
‑
内酰胺的制备方法，其特征是，采用γ
‑
内酰胺酶选择性拆分，分离(+)γ
‑
内酰胺以及(
‑
)γ
‑
内酰胺，将产(+)γ
‑
内酰胺酶的菌株进行5L发酵、底物拆分、产物回收，再通过高效液相色谱法检测菌株对γ
‑
内酰胺的降解情况，包括以下步骤：步骤一、发酵罐培养基制备按5L的发酵体积准备LB培养基。将培养基粉末加入5L发酵罐，加水至4.5L，开蒸汽进夹套阀门使罐温升至100℃，开蒸汽进罐体阀门使罐体温度维持在121℃，灭菌30min；关闭蒸汽进夹套阀门、蒸汽进罐体阀门，通空气吹干空气滤芯，通空气进罐体降温，开恒温水泵使温度下降到设定温度37℃；步骤二、接种按3％接种量接种产(+)γ
‑
内酰胺酶的菌株，待菌液OD
600
值达到0.6
‑
0.8时，加入终浓度5g/L的乳糖；37℃继续培养6h后8000r/min离心30min收获菌体，加入含有50g/L(
±
)γ
‑
内酰胺的1L反应罐，反应过夜，步骤三、产物回收翌日将反应液离心，上清用500mL正丁醇萃取，使用旋转蒸发仪干燥，再将干燥产物溶于少量水，利用冷冻干燥机冻干；步骤四、选择性拆分及HPLC检测取步骤二的发酵取菌液2mL，8000r/min离心5min留沉淀，加10g/L的(
±
)γ
‑
内酰胺溶液1.5mL；充分混匀，25℃摇床反应1h；或者取超声破碎...

【专利技术属性】
技术研发人员：张庆芳，佟欣禹，魏振勇，刘春莹，迟雪梅，王严，夏水英，迟乃玉，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：