VIM酶单克隆抗体及应用制造技术

本发明专利技术涉及单克隆抗体技术领域，尤其是涉及VIM酶单克隆抗体及应用。本发明专利技术提供的VIM酶结合分子特异性好、生物活性高、稳定性强、批间差小，不受细胞株退化影响，与VIM酶亲和力高，效价达到了1:1280000以上，能够用于VIM酶检测或者纯化产品的制备。或者纯化产品的制备。或者纯化产品的制备。

【技术实现步骤摘要】
VIM酶单克隆抗体及应用


[0001]本专利技术涉及单克隆抗体
，尤其是涉及VIM酶单克隆抗体及应用。

技术介绍

[0002]根据碳青霉烯酶活性位点结构与功能基团差异，可将其分为金属β
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内酰胺酶(MBLs或B类酶)和基于丝氨酸的碳青霉烯酶(A和D类酶)两类，VIM型碳青霉烯酶是MBLs的重要成员之一。VIM
‑
2和VIM
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1分别于1996年和1997年于欧洲的铜绿假单胞菌中发现，因2009年新报道的新德里β
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内酰胺酶(NDM
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1)与VIM
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1、VIM
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2序列相似度最高(氨基酸一致性为32％)而再次被广泛关注。随后在世界范围内的肠杆菌科细菌、假单胞菌和不动杆菌中都有报道。迄今为止，已报道了73种VIM变异体，并根据系统发育分析将其分为3组：VIM
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1类，VIM
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2类和VIM
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7类。它能水解几乎所有的β
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内酰胺类抗生素(氨曲南等单环β
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内酰胺类抗生素除外)，研究表明，blaVIM通常与一种或多种氨基糖苷抗性基因共存，并由多种Ⅰ类整合子携带，整合在转座子中，进而容纳在质粒或染色体上，并可随着整合子或质粒的转移实现在革兰氏阴性菌中的传播和流行，造成VIM在世界范围内的广泛传播。此外，还与其他β
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内酰胺酶基因共存，导致广泛耐药和泛耐药菌株的出现，使得临床治疗药物的选择十分有限。目前为止，已在40多个国家和地区的至少23种革兰氏阴性杆菌中检测到VIM。
[0003]多数VIM酶检测方法以酶的水解作用为原理，以肉眼观察结果，其敏感性和特异性会受到主观因素、待测菌的产酶能力等方面的影响，存在误读、漏读的可能，用时较长。显色培养基敏感性范围因不同显色介质有较大的波动。改良Hodge试验对A类和D类酶的检测能力较为突出，对B类酶特异性较差，可能出现假阴性。若菌株能产生ESBLs或AmpC酶，或膜孔蛋白缺失，那么可能导致上述两种方法出现假阳性的结果。Carba NP试验对大多数酶有很好的敏感性，CIM是实验室常用于检测VIM酶的方法，该方法具有较好的敏感性和特异性，但会受到细菌产酶能力的影响。分子生物学检测方法中，PCR方法一般作为检验的金标准，在传统基础上，多种新型的分子生物学技术如实时荧光定量PCR、基因芯片、环介导等温扩增等被开发出来，应用领域逐渐扩大。与传统PCR相比，这些方法在VIM酶检测方面基本具有较高的敏感性和特异性，同时在检测数量、检测时间方面更有优势，但操作难度较高，步骤繁琐，部分试验对操作人员有专业要求，多由专业平台或实验室进行，试验用具、设备等硬件要求高，部分试验要求操作人员进行专业课程的学习，单个检测成本较高。
[0004]就VIM酶的检测方法而言，对已有方法进行改良或建立新的检测方法可作为一种研究思路。建立一种快速检测方法，使其满足高效、准确、高通量的要求，并且价廉易行，检测门槛低，便于大范围推广，同时有较高的敏感性和特异性，对研究人员来说亦是一大挑战。
[0005]单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对特定抗原表位的抗体，通常采用杂交瘤细胞制备，基于细胞融合技术，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤，培养成细胞群后，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体，即单克隆抗体。特异性抗体检测的目的首先是协助临床诊断，在某些疾
病中亦是观察疗效及预后的一个指标，耐药性以及传染病流行病学调查中，特异性抗体的检测也具有特殊的、重要的意义。抗体免疫学检测具有以下优点：特异性高，使用特异的单克隆抗体，可用于单一细胞因子的检测；操作简便、快速，无需依赖细胞株，故不需维持培养，可操作性增加，容易推广和便于普查；影响因素相对较少且容易控制，重复性好，方法容易标准化。
[0006]现有的VIM检测方法特异性差、耗时长，延误患者的诊断和治疗。CN112980803A公开了抗VIM酶杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用，所述单克隆抗体具有纯度效价高、特异性强的特点，适合作为免疫诊断试剂用于体外诊断VIM酶。但是上述单克隆抗体为鼠源单克隆抗体，并且都是采用动物免疫直接获得的单克隆抗体。尽管鼠源单克隆抗体属于使用最广泛的抗体，但仍然存在亲和力弱、特异性差的问题。
[0007]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种VIM酶结合分子，该结合分子能够特异性结合多类VIM酶，将其用于VIM酶检测诊断中，能够进一步提高检测的灵敏度和特异性。
[0009]本专利技术的另一个目的在于，提供一种特异性结合VIM酶的单克隆抗体及含有该单克隆抗体的检测试剂盒。
[0010]为了解决上述技术问题，实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0011]第一方面，本专利技术提供VIM酶结合分子，包括与VIM酶特异性结合的模块a或模块b；
[0012]所述模块a包括第一VH结构域，所述第一VH结构域包括具有SEQ ID No.1(DFWIC)所示氨基酸序列的第一CDR
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H1，具有SEQ ID No.2(CMVPDGSGFGFSASWAKG)所示氨基酸序列的第一CDR
‑
H2和具有SEQ ID No.3(YGDVGGPYSFKL)所示氨基酸序列的第一CDR
‑
H3；
[0013]所述模块b包括第二VH结构域，所述第二VH结构域包括具有SEQ ID No.4(SSSYYWG)所示氨基酸序列的第二CDR
‑
H1，具有SEQ ID No.5(STYYSGSTYYNPSLKS)所示氨基酸序列的第二CDR
‑
H2和具有SEQ ID No.6(HPMVVVTAKFDY)所示氨基酸序列的第二CDR
‑
H3。
[0014]在可选的实施方式中，所述第一VH结构域具有SEQ ID No.13(EVQLVESTGGLVKPGGSLKLSQAASGFTFNNDFWICWFRQAPEKGLEWVACMVPDGSGFGFSASWAKGRATISRDNAKGTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARYGDVGGPYSFKLWGQGTTVTVSS)所示氨基酸序列；
[0015]所述第二VH结构域具有SEQ ID No.14(DVQLQESTPGLVKPSQTVSLTCSVTGISITSSSYYWGWIRVFPGNKLEGIGSTYYSGSTYYNPSLKSRTTITRDTSKYQFFLEMNSLTKEDTATYYCARHPMVVVTAKFDYWGQGTTVTVSS)所示氨基酸序列。
[0016]在可选的实施方式中，所述模块a还包括第一VL结构域，所述第一VL结构域包括具有SEQ ID No.7(RASQSVSSTNLA)所示氨基酸序列的第一CDR
‑
L1，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.VIM酶结合分子，其特征在于，包括与VIM酶特异性结合的模块a或模块b；所述模块a包括第一VH结构域，所述第一VH结构域包括具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第一CDR
‑
H1，具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第一CDR
‑
H2和具有SEQ ID No.3所示氨基酸序列的第一CDR
‑
H3；所述模块b包括第二VH结构域，所述第二VH结构域包括具有SEQ ID No.4所示氨基酸序列的第二CDR
‑
H1，具有SEQ ID No.5所示氨基酸序列的第二CDR
‑
H2和具有SEQ ID No.6所示氨基酸序列的第二CDR
‑
H3。2.根据权利要求1所述的VIM酶结合分子，其特征在于，所述第一VH结构域具有SEQ ID No.13所示氨基酸序列；所述第二VH结构域具有SEQ ID No.14所示氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的VIM酶结合分子，其特征在于，所述模块a还包括第一VL结构域，所述第一VL结构域包括具有SEQ ID No.7所示氨基酸序列的第一CDR
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L1，具有SEQ ID No.8所示氨基酸序列的第一CDR
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L2和具有SEQ ID No.9所示氨基酸序列的第一CDR
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L3；所述模块b还包括第二VL结构域，所述第二VL结构域包括具有SEQ ID No.10所示氨基酸序列的第二CDR
‑
L1，具有SEQ ID No.11所示氨基酸序列的第二CDR<...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯涛，刘春龙，付成华，粟艳，周泽奇，
申请(专利权)人：丹娜湖南生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：