一种能特异性结合PCSK9抗原的纳米抗体及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物医药种的抗体技术领域，具体涉及一种能特异性结合PCSK9抗原的纳米抗体及其制备方法。本发明专利技术所述的纳米抗体来源于驼类的重链抗体可变区，其由框架区(FR区)和互补决定区(CDR区)组成，其中包括三个CDR区如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所示，以及四个FR区如SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：9所示。本发明专利技术的纳米抗体与重组PCSK9蛋白的相互作用良好，能够用于研制抗PCSK9蛋白的抗体类药物，还可用于免疫学检测样本中的PCSK9水平。疫学检测样本中的PCSK9水平。疫学检测样本中的PCSK9水平。

【技术实现步骤摘要】
一种能特异性结合PCSK9抗原的纳米抗体及其制备方法


[0001]本专利技术涉及生物医药种的抗体
，具体涉及一种能特异性结合PCSK9抗原的纳米抗体及其制备方法。

技术介绍

[0002]前蛋白转化酶枯草溶菌素9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)，属于枯草蛋白酶亚家族的一种新的前蛋白转化酶，是常染色体显性家族性高胆固醇血症的重要影响因子之一。研究发现，PCSK9除了能影响血浆胆固醇水平，调节神经细胞的凋亡，还与炎症反应有一定的相关性。目前对于PCSK9的研究主要集中在对肝脏脂质代谢的调节功能。前期的研究显示，PCSK9可通过促进肝细胞的低密度脂蛋白受体(low
‑
density lipoprotein receptor，LDL
‑
R)的降解，调节肝脏脂质代谢，进而影响血浆中低密度脂蛋白胆固醇(low
‑
density lipoprotein cholesterol，LDL
‑
c)的水平。但PCSK9存在两种突变类型，功能获得型突变和功能缺失型突变。族群试验显示，若干PCSK9“获得功能”的突变常发生于体染色体显性高胆固醇血症的个体，而PCSK9“失去功能”的突变则与血浆胆固醇减少有，PCSK9功能缺失型突变个体患冠心病的风险明显降低。2005年，Hobbs等在Dallas Heart Study上报道了携带PCSK9无义突变基因的个体中LDL
‑
c水平会比一般人低28％；在2006，Hobbs等又发表PCSK9基因突变对冠心病的作用，该结果基于一项动脉粥样硬化风险调查，他们对9523个白人和3363个非洲裔美国人进行了长达15年的跟踪观察，发现缺失1个或2个PCSK9功能基因的人群的冠心病的发病率显著低于普通人群。Copenhagen Heart Study发现PCSK9基因的功能性缺失会使LDL
‑
c水平下降11
‑
15％，冠心病患病率下降6
‑
46％。Zimbabwe等报道了PCSK9的缺失突变可使非洲女性的LDL
‑
c水平下降27％。PCSK9抑制剂提供了一种全新的治疗模式来对抗LDL
‑
c，被视为他汀类之后降脂领域取得的最大进步。PCSK9抑制剂的出现，为那些服用他汀类药物时出现严重副作用的患者，及他汀类药物治疗无法达到LDL
‑
c目标水平的患者，如遗传性高胆固醇血症患者带来了福音。
[0003]到目前为止，还没有发现抗PCSK9蛋白单抗类药物有比较明显的毒副作用，只有报道称出现过局部注射反应、腹泻和头疼等较轻微的副作用。赛诺菲的Praluent(Alirocumab)、安进的Repatha(evolocumab)和信达生物的IBI
‑
306(tafolecimab)是目前全球市场仅有的三个获批的人源化的PCSK9抗体。根据汤森路透对2015年获批药物潜力销售排行榜，到2019年Praluent的销售规模将达到44.14亿美元，而Repatha的销售规模将会达到18.62亿美元。我国CVD患者众多，人数已经高达3.3亿，每年约有350多万人死于心血管疾病，然而我国在PCSK9抑制剂领域的研究却严重滞后，完全不能满足CVD患者的需求。
[0004]纳米抗体微小的体积虽为其治疗功能提供了很多的优势，但小分子蛋白在体内极容易被消除。通过基因工程将Nb改造成靶点酶、跨膜蛋白或者双价化能够有效的提高抗体活力和稳定性等，以达到研究目的。在对抑制病毒复制的研究中发现，双价纳米抗体的有效性至少是单价纳米抗体的60倍，并且在动物体内作用时间更长，有效的延迟了动物的死亡时间。抗体药物的前景巨大，但国内抗体药物仍然处于早期阶段。因此，开发国产化低成本
的PCSK9抗体抑制剂，满足我国国民对于抗体药物的迫切需求，具有深远而积极的意义。
[0005]现有技术对于PCSK9纳米抗体的开发集中在鼠源传统抗体，传统抗体无论是大量表达，还是进行抗体人源化都比较困难，耗时长，花费高，并且有效抗体获得率低，严重限制了PCSK9抗体抑制剂的开发，特别是国内抗体药物刚刚处于起步阶段，完全不能满足CVD患者的需求。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种能特异性结合PCSK9抗原的纳米抗体及其制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0008]一种能特异性结合PCSK9抗原的纳米抗体，所述的纳米抗体来源于驼类的重链抗体可变区(VHH)，所述重链抗体可变区(VHH)由框架区(FR区)和互补决定区(CDR区)组成，其中所述互补决定区(CDR)包括互补决定区1(CDR1)，其序列为AMAWFRQA(SEQ ID NO：1)；互补决定区2(CDR2)，其序列为HPAWSGLT(SEQ ID NO：2)；互补决定区3(CDR3)，其序列为AAGLKYPAQKHYDYDY(SEQ ID NO：3)。
[0009]所述重链抗体可变区(VHH)的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0010]一种编码纳米抗体的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包括编码所述SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所示的互补决定区的核苷酸序列。
[0011]所述多核苷酸序列包括编码所述SEQ ID NO：4所示的重链抗体可变区(VHH)的核苷酸序列。
[0012]所述多核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
[0013]一种表达载体，所述表达载体含有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5任一项所述的多核苷酸序列。
[0014]一种宿主细胞，所述宿主细胞含有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5的表达载体，能够表达出特异性结合PCSK9抗原的纳米抗体。
[0015]一种药物组合物，所述药物组合物包含结合PCSK9抗原的所述纳米抗体，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0016]一种制备结合PCSK9抗原的纳米抗体的方法，所述方法包括：将多核苷酸序列的表达载体转化至表达宿主细胞中，培养，进行所述纳米抗体的大量表达和纯化；
[0017]优选的，所述表达载体是pMECS质粒，所述宿主细胞是大肠杆菌HB2151菌株；
[0018]优选的，所述表达载体是pPICZα质粒，所述宿主细胞是酵母X33菌株；
[0019]优选的，所述表达载体是pCDNA3.4质粒，所述宿主细胞是HEK293F细胞株。
[0020]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0021](1)本专利技术首先利用CHO细胞(中华仓鼠卵巢细胞)表达的PCSK9抗原免疫羊驼，分离免疫后的羊驼外周血细胞(PBMC)，从中扩增出针对PCSK9抗原的重链可变区(VHH)文库，删除多余的背景干扰，大大地提高了有效抗体的获得效率。其本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种能特异性结合PCSK9抗原的纳米抗体，其特征在于：所述的纳米抗体来源于驼类的重链抗体可变区(VHH)，所述重链抗体可变区(VHH)由框架区(FR区)和互补决定区(CDR区)组成，其中所述互补决定区(CDR)包括互补决定区1(CDR1)，其序列为AMAWFRQA(SEQ ID NO：1)；互补决定区2(CDR2)，其序列为HPAWSGLT(SEQ ID NO：2)；互补决定区3(CDR3)，其序列为AAGLKYPAQKHYDYDY(SEQ ID NO：3)。2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述重链抗体可变区(VHH)的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。3.一种编码权利要求1或2所述的纳米抗体的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列包括编码所述SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所示的互补决定区的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列包括编码所述SEQ ID NO：4所示的重链抗体可变区(VHH)的核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：李新洋，李小康，王青青，洪军，郑城洋，王雨欢，
申请(专利权)人：河南城建学院，
类型：发明
国别省市：