抑制性抗ENPP1抗体制造技术

在某些方面，本文提供了抑制性抗ENPP1抗体及其抗原结合片段。在一些方面，本文提供了使用本文提供的所述抗体来治疗心肌梗塞的方法。在某些方面，本文提供了编码本文提供的所述抗体的核酸分子、包含此类核酸的宿主细胞以及使用此类宿主细胞来制备本文提供的所述抗体的方法。在一些方面，本文还提供了包含本文提供的所述抗体的药物组合物。提供的所述抗体的药物组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抑制性抗ENPP1抗体
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年5月4日提交的美国临时专利申请序列号63/019,773的优先权权益，该临时专利申请的内容据此以引用的方式整体并入本文。
[0003]政府支持
[0004]本专利技术受政府支持在美国国家卫生研究院颁发的资助号HL137241、AR075867和美国国防部颁发的资助号W81XWH
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0464下进行。政府对本专利技术享有一定的权利。

技术介绍

[0005]在急性缺血性损伤后，心脏使死亡心肌再生的能力很差，并且丧失的心肌被非收缩性疤痕组织替代。这种疤痕组织增加了其余心肌的血液动力学负担，并且随时间推移，心室通常会衰竭，导致心室扩张、纤维化恶化和心脏功能的进行性下降的循环。瘢痕组织是心脏损伤后死亡和心血管结局的独立预测因子。每年有超过700,000名患者被诊断为心力衰竭，其中超过40％是心脏病发作或心肌梗塞的结果。因此，调节心脏伤口愈合以将心脏损伤反应从纤维化反应重定向到修复性反应，同时使不良的心脏功能重塑和下降最小化是心血管治疗的未满足的需求。

技术实现思路

[0006]在某些方面，本文提供了涉及特异性结合至ENPP1并且抑制ENPP1的抗体的组合物和方法，此类抗体可以用于例如促进心肌梗塞后受试者的心脏伤口愈合。因此，在某些实施方案中，本文提供了对ENPP1具有特异性的抗体、包含此类抗体的药物组合物、制备此类抗体的方法以及使用此类抗体例如治疗心肌梗塞、改善心脏伤口愈合以及预防心力衰竭的方法。
附图说明
[0007]图1展示了ENPP1在心脏伤口愈合中的作用。(A)损伤导致肌细胞释放ATP。(B)损伤诱导心脏成纤维细胞表达ENPP1，所述ENPP1将ATP水解为AMP和PPi。(C)AMP/PPi或另外的下游物质诱导炎性细胞因子的表达，(D)炎性细胞因子作用于成纤维细胞、巨噬细胞和内皮细胞以诱导细胞死亡。(E)非肌细胞的细胞死亡导致伤口愈合中断。
[0008]图2A显示了示例性qPCR结果，其表明与同一心脏的未受损伤的区域相比，ENPP1在心脏的受损伤的区域的表达增加(n＝10只动物/组，**p<0.01)。
[0009]图2B显示了在缺血性心脏损伤后同一心脏的未受损伤的和受损伤的区域的ENPP1的示例性蛋白质印迹分析(M1、M2和M3是指经受缺血性损伤的动物的心脏)，其中GAPDH作为上样对照，以及展示同一心脏的受损伤的区域与未受损伤的区域的ENPP1蛋白表达增加的程度的半定量密度测定法(n＝5只动物/组，*p<0.05)。
[0010]图2C是示例性显微照片，其显示了心脏的未受损伤的和受损伤的区域的苏木精和伊红染色(上图)以及ENPP1的免疫染色(下图，绿色)。方框展示了成像的区域。n＝5只动物
的代表性图像。
[0011]图3是示例性显微照片，其显示在缺血性心脏损伤后在心脏的受损伤的区域中ENPP1由心脏成纤维细胞表达。在损伤后7天，在TCF21MerCreMer:R26R
tdtomato
(图A)和Col1a2CreERT:R26R
tdtomato
(图B)的心脏的未受损伤的和受损伤的区域(损伤后第7天)中ENPP1的表达展示出心脏成纤维细胞(红色，箭头)的ENPP1(绿色)表达显著增加。在损伤后野生型小鼠的波形蛋白(成纤维细胞标志物，图C)的免疫染色显示，表达波形蛋白的心脏成纤维细胞(红色，箭头)同样表达ENPP1。
[0012]图4A和4B是使用10X基因组学平台进行的在损伤后7天心脏中的非肌细胞的单细胞RNA测序的示例性结果。图4A是在损伤后7天使用典型转录物组学标志进行的心脏中的不同细胞群的聚类图示，其显示了心脏成纤维细胞、巨噬细胞和其他细胞类型的群体。图4B是ENPP1表达的叠加图，其展示了成纤维细胞的表达占优势，巨噬细胞和其他分散细胞类型的表达程度较低。
[0013]图5A是展示在心脏损伤后在不同时间点心脏中的不同外切核苷酸酶的基因表达的热图。红色矩形标示了ENPP1表达，在损伤后3、7、14和21天与未受损伤的组织(Un)相比，所述ENPP1在受损伤的组织(In)中的表达显著增加。
[0014]图5B是显示从野生型和ENPP1突变体(ENPP1asj/asj)小鼠提取的受损伤的组织的ATP水解活性的示例性图，并且展示了在野生型小鼠的受损伤的组织中水解活性显著增加，而突变体小鼠则未观察到此结果(*p<0.05，n＝5)。
[0015]图6A是示例性显微照片，其显示在存在ATP的情况下表达ENPP1的心脏成纤维细胞(绿色)和肌细胞(红色)的共培养物诱导心脏成纤维细胞的细胞死亡。在不存在(图A)或存在(图B)ATP的情况下，将对照心脏成纤维细胞(绿色)与新生大鼠心肌细胞一起共培养，然后通过流式细胞术来估计细胞存活率。在不存在(图C)或存在(图D)ATP的情况下，将过表达ENPP1(绿色)的心脏成纤维细胞与心肌细胞一起共培养。图D中的绿色染色细胞的显著减少表明活心脏成纤维细胞的数量显著减少。在此系统中未观察到心肌细胞的显著死亡。
[0016]图6B是显示在图6A中进行的测定法的流式细胞术结果的示例性图。
[0017]图7是示例性明视野显微照片和定量图，其显示ENPP1诱导促凋亡分子从心肌细胞的释放，所述促凋亡分子诱导多种驻留心脏细胞的细胞死亡、恶化细胞死亡和炎症。将ENPP1和ATP添加至心肌细胞并收集条件培养基。将ENPP1条件培养基添加至在单独的培养皿上生长的其他心脏驻留细胞，诸如巨噬细胞、内皮细胞、心脏成纤维细胞和平滑肌细胞。在用对照或条件培养基孵育48小时后，用明视野显微镜对经处理的细胞成像，并且对细胞进行流式细胞术，以通过PI染色来确定细胞死亡程度。数据表明，在用ENPP1和ATP条件培养基处理后，明相显微镜下的贴壁细胞的数量减少，细胞死亡增加，并且PI阳性细胞的数量显著增加(**p<0.01，*p<0.05，n＝6)。
[0018]图8是显示在对照或异丙肾上腺素输注后在100个小鼠品系中ENPP1表达的遗传变异的图。在异丙肾上腺素输注3周后，100个小鼠品系心脏中的归一化的ENPP1表达。在大多数品系的异丙肾上腺素输注(红色条柱)后，ENPP1表达的遗传变异表明，与对照条件(黑色条柱)相比，在异丙肾上腺素后心脏ENPP1表达增加。
[0019]图9是展示心脏性状(心脏质量、射血分数、LVID(心室大小)、E/A比率、间质纤维化和心率)与100个品系中的心脏ENPP1表达的相关性的示例性图。在每个图中，每个点代表一
个小鼠的品系，并且归一化的ENPP1表达沿着X轴绘制。Y轴表示心脏性状的测量值。显示了两种不同的条件(对照和在异丙肾上腺素输注后)。ENPP1与对照条件下的心脏性状不具有强相关性。ENPP1与在异丙肾上腺素输注后的心脏质量、纤维化、心室大小、E本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：a)重链可变区序列，其与表2、表4或表6中列出的重链可变区序列具有至少约95％序列同一性；和/或b)轻链序列，其与表2、表4或表6中列出的轻链可变区序列具有至少约95％同一性。2.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:26的重链CDRH3序列。3.如权利要求2所述的抗体，所述抗体还包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:24的重链CDRH1序列。4.如权利要求2或权利要求3所述的抗体，所述抗体还包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:25的重链CDRH2序列。5.如权利要求2至4中任一项所述的抗体，所述抗体还包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:23的轻链CDRL3序列。6.如权利要求2至5中任一项所述的抗体，所述抗体还包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:21的轻链CDRL1序列。7.如权利要求2至6中任一项所述的抗体，所述抗体还包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:22的轻链CDRL2序列。8.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：a)重链，其包含SEQ ID NO:4的CDRH1、SEQ ID NO:5的CDRH2和SEQ ID NO:6的CDRH3；以及b)轻链，其包含SEQ ID NO:1的CDRL1、SEQ ID NO:2的CDRL2和SEQ ID NO:3的CDRL3。9.如权利要求8所述的抗体，所述抗体包含：i)重链可变区序列，其与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性；以及ii)轻链可变区序列，其与SEQ ID NO:9具有至少95％同一性。10.如权利要求8所述的抗体，所述抗体包含：i)SEQ ID NO:7的重链可变区序列；以及ii)SEQ ID NO:9的轻链可变区序列。11.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：a)重链，其包含SEQ ID NO:14的CDRH1、SEQ ID NO:15的CDRH2和SEQ ID NO:16的CDRH3；以及b)轻链，其包含SEQ ID NO:11的CDRL1、SEQ ID NO:12的CDRL2和SEQ ID NO:13的CDRL3。12.如权利要求11所述的抗体，所述抗体包含：i)重链可变区序列，其与SEQ ID NO:17具有至少95％同一性；以及ii)轻链可变区序列，其与SEQ ID NO:19具有至少95％同一性。13.如权利要求11所述的抗体，所述抗体包含：i)SEQ ID NO:17的重链可变区序列；以及ii)SEQ ID NO:19的轻链可变区序列。14.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：a)重链，其包含SEQ ID NO:24的CDRH1、SEQ ID NO:25的CDRH2和SEQ ID NO:26的
CDRH3；以及b)轻链，其包含SEQ ID NO:21的CDRL1、SEQ ID NO:22的CDRL2和SEQ ID NO:23的CDRL3。15.如权利要求14所述的抗体，所述抗体包含：i)重链可变区序列，其与SEQ ID NO:27具有至少95％同一性；以及ii)轻链可变区序列，其与SEQ ID NO:29具有至少95％同一性。16.如权利要求14所述的抗体，所述抗体包含：i)SEQ ID NO:27的重链可变区序列；以及ii)SEQ ID NO:29的轻链可变区序列。17.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与如权利要求1
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16中任一项所述的抗体竞争与ENPP1的结合。18.如权利要求1
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17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是鼠的、嵌合的或人源化的。19.如权利要求1
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18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是完整IgG同种型抗体。20.如权利要求1
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18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：