抗PD-1纳米抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了抗PD

【技术实现步骤摘要】
抗PD
‑
1纳米抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及抗PD
‑
1纳米抗体及其应用。

技术介绍

[0002]在经典免疫监视理论中，免疫系统可以识别肿瘤抗原并将肿瘤细胞消除。致癌基因的激活导致肿瘤细胞改变自身及肿瘤微环境，使得免疫系统和肿瘤细胞间的平衡被打破。当免疫系统和肿瘤细胞进入逃逸阶段，肿瘤细胞的恶性程度会提高，而肿瘤细胞丢失MHC分子使其避免被免疫细胞识别和消除。肿瘤微环境也可以通过释放免疫抑制因子抑制免疫系统，如IL
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10，TGF
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β等。肿瘤细胞表面也会高表达免疫抑制蛋白(如PD
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1，PD
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L1)，当效应T细胞与肿瘤细胞结合时，PD
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L1与PD
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1相互作用并诱导T细胞发生凋亡，这是肿瘤对免疫系统产生耐受的主要原因之一，肿瘤迅速生长，发生转移。如果人为激活宿主的免疫系统并将其重定向到肿瘤细胞，从理论上来讲肿瘤组织就能够被清除，而免疫治疗的理论已经在临床治疗中得到广泛证明。
[0003]PD
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1(程序性死亡受体1)，也称为CD279(分化簇279)，是一种重要的免疫抑制分子。PD
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1(CD279)最早于1992年被报道，人PD
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1编码基因PDCD1位于2q37.3，全长2097bp，由6个外显子组成，翻译产物为288个氨基酸组成的PD
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1前体蛋白，剪切前20个氨基酸组成的信号肽后得到成熟蛋白质。PD
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1包括胞外免疫球蛋白可变区IgV结构域，疏水跨膜结构域和胞内结构域，胞内尾部结构域N端ITIM基序包含2个磷酸化位点，C端则是一个ITSM基序。PD
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1是膜蛋白，属于CD28免疫球蛋白超家族，主要表达在激活后的T细胞表面，此外还在胸腺的CD4
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CD8
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T细胞、活化的NK细胞和单核细胞有低丰度表达。PD
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1有2个配体，分别是B7蛋白家族的PD
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L1(CD274,B7
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H1)和PD
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L2(CD273,B7
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DC)，PD
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L1和PD
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L2氨基酸序列有40％相同。两者区别主要在于表达模式不同，PD
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L1组成性的低表达于APCs、非造血细胞(如血管内皮细胞、胰岛细胞)和免疫豁免部位(如胎盘、睾丸和眼睛)，炎性细胞因子如I型和II型干扰素、TNF
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α和VEGF等均可以诱导PD
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L1的表达。PD
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L2则只在被激活的巨噬细胞和树突细胞中有表达。PD
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1与PD
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L1在激活的T细胞结合后，PD
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1的ITSM基序发生酪氨酸磷酸化，进而导致下游蛋白激酶Syk和PI3K的去磷酸化，抑制下游AKT、ERK等通路的活化，最终抑制T细胞活化所需基因及细胞因子的转录和翻译，发挥负向调控T细胞活性的作用。
[0004]在肿瘤细胞中，肿瘤细胞及肿瘤微环境通过上调PD
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L1表达并与肿瘤特异的CD8+T细胞表面的PD
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1结合，负调控T细胞活性，抑制免疫反应。肿瘤细胞可以通过以下4种途径上调PD
‑
L1表达：1.编码PD
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L1的基因扩增(9p24.1)；2.EGFR、MAPK、PI3K
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Akt信号通路激活，HIF
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1转录因子等可以从转录水平上调PD
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L1的表达；3.EB病毒的诱导(EB病毒阳性的胃癌和鼻咽癌表现为PD
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L1高表达)；4.表观遗传学的调控。在肿瘤微环境中，interferon
‑
γ等炎症因子的刺激同样可以诱导PD
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L1和PD
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L2的表达。炎症因子可以诱导肿瘤微环境中其他细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞和基质细胞表达PD
‑
L1和PD
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L2，而能够识别肿瘤抗原的肿瘤浸润性T细胞能够分泌interferon
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γ，进而诱导PD
‑
L1表达上调，这一过程被称为“适应性免疫抵抗”，肿瘤细胞通过这一机制可以实现自我保护。有越来越多的证据表明肿瘤利用
PD
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1依赖的免疫抑制免疫逃避。在各种实体瘤和血液系统恶性肿瘤种均已经发现PD
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L1和PD
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L2的高表达。此外，PD
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Ls的表达与肿瘤细胞的不良预后之间具有很强相关性，已证明的包括食道癌、胃癌、肾癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌和黑色素瘤等。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供抗PD
‑
1纳米抗体及其应用。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术提供一种抗PD
‑
1纳米抗体，其包括：VHH链，所述VHH链的互补决定区包括CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示。
[0007]可选的，所述VHH链的氨基酸序列包括：选自SEQ ID NO:5、6或SEQ ID NO:12
‑
18中任意一项所示，或与其具有至少85％、90％、95％、97％、或99％同一性的序列。
[0008]本专利技术还提供了一种融合蛋白，其包括：所述的抗PD
‑
1纳米抗体。
[0009]可选的，所述的融合蛋白还包括：Fc段；所述Fc段与所述抗PD
‑
1纳米抗体的N端或C端融合。
[0010]可选的，所述融合蛋白还包括：除所述抗PD
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1纳米抗体和所述Fc段以外的其他功能片段；所述Fc段与所述抗PD
‑
1纳米抗体融合，和/或，所述Fc段与所述其他功能片段融合。
[0011]可选的，所述的Fc段选自人源IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4或其变体；优选的，所述Fc段选自人源IgG1的变体；优选的，所述Fc结构域选择消除免疫效应功能，优选包含以下任一突变方式，以下突变为根据EU计数：
[0012][0013]本专利技术还提供了一种抗PD
‑
1抗体分子，其包括：一个或多个所述的抗PD
‑
1纳米抗体；或包括：所述的融合蛋白；所述抗PD
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1抗体分子为单价抗体、双价或多价抗体、双特异抗体、或多特异抗体。
[0014]本专利技术还提供了一种嵌合抗原受体，包括胞外抗原结合域、跨膜结构本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗PD
‑
1纳米抗体，其特征在于，包括：VHH链，所述VHH链的互补决定区包括CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示。2.根据权利要求1所述的抗PD
‑
1纳米抗体，其特征在于，所述VHH链的氨基酸序列包括：选自SEQ ID NO:5、6或SEQ ID NO:12
‑
18中任意一项所示，或与其具有至少85％、90％、95％、97％、或99％同一性的序列。3.一种融合蛋白，其特征在于，包括：权利要求1或2所述的抗PD
‑
1纳米抗体。4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，还包括：Fc段；所述Fc段与所述抗PD
‑
1纳米抗体的N端或C端融合。5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括：除所述抗PD
‑
1纳米抗体和所述Fc段以外的其他功能片段；所述Fc段与所述抗PD
‑
1纳米抗体融合，和/或，所述Fc段与所述其他功能片段融合。6.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，还包括：Fc段；所述的Fc段选自人源IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4或其变体；优选的，所述Fc段选自人源IgG1的变体；优选的，所述Fc结构域选择消除免疫效应功能，优选包含以下任一突变方式，以下突变为根据EU计数：7.一种抗PD
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1抗体分子，其特征在于，包括：一个或多个权利要求1或2所述的抗PD
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【专利技术属性】
技术研发人员：屈向东，潘琴，都业杰，金后聪，
申请(专利权)人：启愈生物技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：