抗原靶向、抗CD16A和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了抗原靶向、抗CD16A和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其包括：特异性结合CD16A的CD16A结合区、特异性结合肿瘤相关抗原(TAA)的TAA结合区、IL

【技术实现步骤摘要】
抗原靶向、抗CD16A和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及抗原靶向、抗CD16A和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白及其应用。

技术介绍

[0002]自然杀伤细胞(NK细胞)是一种天然免疫细胞，能够非常有效地破坏应激细胞，如病毒感染或肿瘤转化细胞。NK细胞具有不受MHC限制的细胞毒性、产生细胞因子和免疫记忆等功能，使其成为免疫反应系统中的关键角色。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是一种有效的细胞毒性机制，主要通过自然杀伤(NK)细胞介导。通过CD16a的ADCC作用是NK细胞抗肿瘤效应的主要机制之一。当特异性抗体结合到靶向肿瘤细胞膜上以后，免疫细胞通过该反应诱导细胞死亡。
[0003]抗体和免疫细胞的相互作用通过Fc受体(FcR)家族发生。在人类中，IgG的FcR家族(FcγR)由6个受体组成：FcγRI/CD64、FcγRIIa/CD32a、FcγRIIb/CD32b、FcγRIIc/CD32c、FcγRIIIa/CD16a和FcγRIIIb/CD16b，其中CD16a主要触发NK细胞介导的ADCC。通常情况下，ADCC效应主要通过结合FcγRIII(CD16)的抗体激活NK细胞。人类NK细胞分为两个主要亚群：CD56 bright和CD56 dim。CD56 bright NK细胞是强有力的细胞因子产生者，但缺乏CD16a；而CD56dim具有高度的细胞毒性，表达CD16a。当通过CD16a识别IgG调理的靶点时，NK细胞就会释放不同的细胞毒性分子，从而引发靶细胞的死亡。这种机制依赖于免疫突触的形成和含有穿孔素和颗粒酶的溶解颗粒的脱颗粒。除了脱颗粒外，NK细胞还可以通过将靶死亡受体(如DR4、DR5或Fas)与其死亡受体配体(如FasL和TRAIL)结合来清除靶细胞。
[0004]CD16a是一种跨膜受体，具有短的C
‑
ter胞质尾，并具有两个细胞外Ig样结构域。CD16a与IgG的CH2以1:1的方式相互作用，其中CH2上的N297位的N
‑
聚糖链在这种相互作用中也起着关键作用。CD16a在其细胞质尾部没有ITAM结构域，因此需要两条含有ITAM结构域的细胞内链串联的帮助，CD3ζ和Fc∈RIγ。CD16a结合后，属于Src家族的激酶Lck被激活，并磷酸化CD3ζ和/或Fc∈RIγ的ITAM结构域。磷酸化的ITAM允许来自Syk家族的激酶招募和磷酸化，例如Syk和ZAP
‑
70，它们反过来负责后续的信号传导。在它们的底物中，PI3K是高度相关的，因为它将PIP2转化为PIP3，PIP3经PLC
‑
γ处理后释放IP3和DAG。DAG激活PKC家族，这有助于触发脱颗粒。IP3诱导钙从内质网释放，这种钙内流是ADCC触发的主要信号之一，也导致核内NFAT易位，诱导其靶基因的转录。CD16a参与激活的其他途径也有助于ADCC，例如ERK2 MAPK途径。CD16a依赖性NK细胞杀伤后，CD16a迅速下调。CD16a脱落的机制之一是由去整合素和金属蛋白酶17(ADAM17)介导的，后者在NK细胞上表达。ADAM17对CD16a的切割发生在顺式结构中，这意味着表达ADAM17的NK细胞不能在另一个NK细胞上诱导CD16a脱落。激活后CD16a下调的另一个机制是内化，这不仅发生在CD16a上，也发生在其他细胞内信号成分上，如CD3ζ、ZAP
‑
70和Syk。
[0005]NK细胞作为先天性免疫细胞中的杀伤细胞，可直接杀伤病原体和肿瘤细胞。与T细
胞相比，NK细胞具有更强的肿瘤识别和杀伤能力，以及更强的现货型应用的潜质。如何改造治疗性抗体药物的恒定区(Fc端)使其更好地激活先天免疫反应，增强抗体依赖的细胞毒作用(ADCC，antibody
‑
dependent cell
‑
mediated cytotoxicity)，如何评估能够特异性结合CD16A的双(多)抗药效是药物研发科学家所感兴趣的问题。目前提高ADCC作用的策略主要从下面几个方面：
[0006](1)细胞因子：提高ADCC活性的一个简单方法是用促炎细胞因子刺激NK细胞。NK细胞移植已在多个临床试验中成功进行，例如通过输注细胞因子诱导记忆样(CIML)NK细胞，最常用的细胞因子组合包括IL
‑
12、IL
‑
15和IL
‑
18。CIML NK细胞比传统NK细胞表达更多的IFN
‑
γ，对白血病细胞和原发性急性髓系白血病(AML)母细胞显示出优越的细胞毒性。IL
‑
12会增加NK细胞产生IFN
‑
γ和TNF
‑
α，在一项I/II期临床试验中，西妥昔单抗与IL
‑
12联合应用于无法切除或复发的头颈部鳞状细胞癌患者。与无进展生存期(PFS)小于100天的患者相比，PFS大于100天的患者NK细胞在体外具有更高的ADCC活性。IL
‑
15是NK和CD8+T细胞生存和功能所必需的细胞因子。N
‑
803是一种突变的N72D IL
‑
15超激动剂，在临床前模型和临床试验中显示出增强的NK细胞体外和体内活性。此外，它还增加了NK和CD8+T细胞的数量。
[0007](2)抑制ADAM17：ADAM17是激活后CD16a下调的主要驱动因素。改善NK细胞ADCC的一种策略是通过靶向ADAM17来防止CD16a脱落。研究发现，对NK细胞中使用CRISPR/Cas9技术敲除ADAM17，显示出更好的IFN
‑
γ生成和体内外ADCC活性。然而，也有研究显示，阻断ADAM17降低了NK细胞的存活率以及CD16a介导的连环杀伤，细胞无法与靶细胞分离，阻碍其运动到另一个靶细胞。总之，ADAM17抑制的益处尚不清楚，结果也有争议。这一策略是否能够成功，有待于一项正在进行的临床试验(NCT04023071)结果，该试验将评估携带不可切割CD16a的iPSC衍生NK细胞在AML和B细胞淋巴瘤中的应用。
[0008](3)工程化抗体：抗体的Fc部分进行工程化改造，可以增加Fc对CD16a的亲和力，并随后改善ADCC。一些突变非常流行，例如，所谓的GASDALIE，由Fc中的4个替换组成：G236A/S239D/A330L/I332E。该突变显示对CD16a的亲和力显著增加，而CD32b亲和力几乎没有增加。另一个突变称为突变体18(F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L)，ADCC显著增加。这些突变现已作为抗HER2抗体margetuximab进入临床，并在I期治疗各种HER2阳性癌时显示出良好的效果。此外，抗体Fc N
‑
聚糖的糖工程化有望增加对CD16a的亲和力。研究最多的糖修饰是去糖基化，例如去岩藻糖修饰。这种修饰导致与CD16a的结合增加，ADCC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗原靶向、抗CD16A和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述抗原包括肿瘤相关抗原(TAA)；所述三功能融合蛋白包括：特异性结合CD16A的CD16A结合区、特异性结合肿瘤相关抗原(TAA)的TAA结合区、IL
‑
15和IL
‑
15Rα结合形成的IL
‑
15/IL
‑
15Rα复合物、以及Fc结构域。2.根据权利要求1所述的抗原靶向、抗CD16A和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述CD16A结合区包括抗CD16A抗体或其抗原结合片段，优选的，所述CD16A结合区为靶向CD16A的Fab片段或Fv片段。3.根据权利要求1所述的抗原靶向、抗CD16A和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述TAA结合区包括抗TAA抗体或其抗原结合片段，优选的，所述TAA结合区为靶向TAA的Fab片段或Fv片段。4.根据权利要求1所述的抗原靶向、抗CD16A和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白还包括连接片段；所述连接片段的氨基酸序列优选为若干个GS重复序列。5.根据权利要求1所述的抗原靶向、抗CD16A和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含若干条肽链，所述IL
‑
15和所述IL
‑
15Rα分别位于不同肽链上。6.根据权利要求1所述的抗原靶向、抗CD16A和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包括：第一单体和第二单体；所述第一单体包括：所述的TAA结合区和第一Fc链；所述第二单体包括：所述的CD16A结合区、所述的IL
‑
15/IL
‑
15Rα复合物和第二Fc链；所述第一Fc链和所述第二Fc链聚合形成所述的Fc结构域。7.根据权利要求6所述的抗原靶向、抗CD16A和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述TAA结合区为靶向TAA的Fab片段；所述CD16A结合区为靶向CD16A的Fv片段。8.根据权利要求1所述的抗原靶向、抗CD16A和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包括：第一单体和第二单体；所述第一单体包括：所述的CD16A结合区和第一Fc链；所述第二单体包括：所述的TAA结合区、所述的IL
‑
15/IL
‑
15Rα复合物和第二Fc链；所述第一Fc链和所述第二Fc链聚合形成所述的Fc结构域。9.根据权利要求8所述的抗原靶向、抗CD16A和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述CD16A结合区为靶向CD16A的Fab片段；所述TAA结合区为靶向TAA的Fv片段。10.根据权利要求6或8所述的抗原靶向、抗CD16A和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述第一单体包括第一肽链和第二肽链，所述第二单体包括第三肽链和第四肽链；所述第一肽链包括：由VL结构域和CL结构域融合形成的轻链；所述第二肽链包括：由VH结构域、CH1结构域和第一Fc链融合形成的重链；所述第三肽链包括：抗体可变区、细胞因子和第二Fc链；所述第四肽链包括：抗体可变区、细胞因子；所述第一肽链的VL结构域、CL结构域，以及所述第二肽链的VH结构域、CH1结构域配对形成Fab片段；所述第三肽链的抗体可变区和所述第四肽链的抗体可变区配对形成Fv片段；
所述第三肽链的细胞因子和所述第四肽链的细胞因子结合形成所述的IL
‑
15/IL
‑
15Rα复合物；其中，所述的Fab片段靶向TAA，所述的Fv片段靶向CD16A；或者，所述的Fab片段靶向CD16A，所述的Fv片段靶向TAA。11.根据权利要求10所述的抗原靶向、抗CD16A和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，配对形成所述Fv片段的抗体可变区选自VH结构域和VL结构域；所述的细胞因子选自IL
‑
15和IL
‑
15Rα。12.根据权利要求11所述的抗原靶向、抗CD16A和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，配对形成所述Fv片段的VH结构域和VL结构域之间具有一对或多对二硫键，并且包含以下突变组合形式的任意一种以上，根据EU计数：且包含以下突变组合形式的任意一种以上，根据EU计数：13.根据权利要求10所述的抗原靶向、抗CD16A和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，自肽链的N端到C端，所述第三肽链的融合顺序为：抗体可变区～细胞因子～第二Fc链，或为：细胞因子～抗体可变区～第二Fc链；自肽链的N端到C端，所述第四肽链的融合顺序为：抗体可变区～细胞因子；或为：细胞因子～抗体可变区；“～”表示连接片段。14.根据权利要求1所述的抗原靶向、抗CD16A和免疫效应细胞激活三功能融合蛋白，其特征在于，所述IL
‑
15包括：IL
‑
15及其能结合IL
‑
15Ra的突变，截短及各种衍生物；所述IL
‑
15Ra包括：IL
‑
15Ra及其能结合IL
‑
15的突变，截短及各种衍生物；优选地，所述IL
‑
15包括但不限于以下任意一组合所示的突变方式，计数方式根据IL
‑
15的氨基酸序列的第一个氨基酸开始算为第1位；
或者，所述IL
‑
15/IL
‑
15Ra复合物包括但不限于以下任意一组合所示的突变方式，计数方式根据IL
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：屈向东，潘琴，
申请(专利权)人：启愈生物技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：