抗CXCR4单域抗体、双特异性抗体及药物偶联物制造技术

本发明专利技术提供了一种亲和力降低的抗CXCR4单域抗体、基于亲和力降低的抗CXCR4单域抗体的双特异性抗体及其药物偶联物；所述亲和力降低的双特异性抗体或双特异性抗体ADC其在细胞内的内化不依赖于细胞表面的受体比率(有效性提高)，并且对细胞的选择性大大提高(有效性提高、毒性降低)，为本领域构建有效靶向肿瘤、同时降低对正常细胞毒性的ADC的提高了有益的参考。考。

【技术实现步骤摘要】
抗CXCR4单域抗体、双特异性抗体及药物偶联物

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[0001]本专利技术涉及一种抗CXCR4单域抗体、基于抗CXCR4单域抗体的双特异性抗体及药物偶联物，具体涉及一种亲和力降低的抗CXCR4单域抗体、基于亲和力降低的抗CXCR4单域抗体的双特异性抗体及其药物偶联物。
[0002]背景：
[0003]抗体药物偶联物(ADC)是一种新兴的肿瘤治疗平台，可选择性地向表达癌症特异性受体的肿瘤细胞递送细胞毒药物(Beck,A.et al,Nat Rev Drug Discov 2017,16(5),315
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337；Khongorzul,P.et al,Mol Cancer Res 2020,18(1),3
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19；Sievers,E.L.et al,Annu Rev Med 2013,64(1),15
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29)。利用单克隆抗体对肿瘤表面受体的特异性识别以及细胞毒药物的效力，ADC显著提高了细胞毒药物化学疗法的治疗指数(TI)。到目前为止，已有11种ADC上市，另有80多种ADCs正处于临床开发阶段，用于各种血液和实体恶性肿瘤(Coats,S.et al,Clin Cancer Res 2019,25(18),5441
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5448)。理想的ADC靶受体应该在肿瘤中具有高表达水平，而在正常组织中很少或没有表达以确保有效和选择性的负载细胞毒药物。此外，ADC必须能够被靶细胞有效地内化并运输到溶酶体以确保所载药物能够释放(Ritchie,M.et al,MAbs 2013,5(1),13
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21)。尽管ADC在癌症治疗方面取得了巨大成功，但由于缺乏可靶向的癌症相关受体，新型ADC的开发仍然受到限制。
[0004]CXCR4(CD184)是一种G蛋白偶联受体，与各种血液和非血液学恶性肿瘤的进展有关(Karpova,D.et al,Stem Cells 2015,33(8),2391
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9；Ratajczak,M.Z.et al,Leukemia 2006,20(11),1915
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24)。CXCR4在多种人类癌症中表达，是乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤和急性髓细胞白血病等癌症的不良预后marker(Chatterjee,S.et al,Adv Cancer Res 2014,124,31
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82；Okuyama Kishima,M.et al,Anal Cell Pathol(Amst)2015,2015,891020；Spoo,A.C.et al,Blood 2007,109(2),786
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91)。此外，在转移性恶性肿瘤和肿瘤干细胞(cancer steem cell，CSC)中可见CXCR4的表达上调。最近的研究评估了CXCR4作为治疗血液恶性肿瘤和转移性实体瘤潜在靶点的可能性(Cancilla,D.et al,Front Oncol 2020,10,1672；Zhou,W.et al,Curr Med Chem 2019,26(17),3026
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3041)，已经有多个CXCR4拮抗剂如AMD3100(Plerixafor，小分子CXCR4拮抗剂)、BTK140(14个氨基酸残基的合成肽)和anti
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CXCR4抗体(如BMS
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936564)等正处于用于治疗AML和多发性骨髓瘤的临床研究阶段(Broussas,M.et al,Mol Cancer Ther 2016,15(8),1890
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9；Kuhne,M.R.et al,Clin Cancer Res 2013,19(2),357
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66)。此外，由于CXCR4与其配体结合后可被靶细胞有效内化，因此，基于CXCR4的ADC开发被视为治疗肿瘤的一种潜在治疗策略(Costa,M.J.et al,Sci Rep 2019,9(1),2443；Kularatne,S.A.et al,Angew Chem Int Ed Engl 2014,53(44),11863
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7)。
[0005]然而，由于CXCR4广泛表达于正常细胞特别是造血细胞和淋巴细胞上，靶向CXCR4的ADC可能会对正常组织造成毒性(Nimmagadda,S.et al,J Nucl Med 2009,50(7),1124
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30)。因此，靶向CXCR4、肿瘤特异性的ADC为实现针对各种血液和实体恶性肿瘤的有效、安全的治疗提供了有吸引力的机会。
[0006]B淋巴细胞特异性抗原CD20是一种经过充分验证的、治疗B细胞相关恶性肿瘤的有效靶点。然而，抗CD20单克隆抗体的有效性在一定程度上受到治疗耐受的限制(Beider,K.et al,Clin Cancer Res 2013,19(13),3495
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507；Glennie,M.J.et al,Mol Immunol 2007,44(16),3823
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37)。此外，CD20内化性很差也限制了其作为ADC靶受体的应用(Dransfield,I.,Blood 2014；123(5):606
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7)。

技术实现思路
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[0007]双特异性抗体是提高ADC功效或选择性的可行策略。目前主要存在两类双特异性ADC。第一类双特异性ADC靶向细胞表面受体和溶酶体目标受体，通过增加溶酶体转运，提高ADC的疗效。而另一类双特异性ADC通过同时结合两个细胞表面受体提高对细胞的选择性，其中有一个亚类，其可同时靶向非内化受体和快速内化受体，大大拓宽了可用于ADC的双特异性抗体的组合。但是这种同时靶向非内化受体和快速内化受体的双特异性ADC，其是否内化以及内化的强弱高度依赖于细胞表面的受体比率，极大限制了可以从双特异性ADC中受益的患者比例。
[0008]本专利技术在快速内化的抗CXCR4 CDR区引入突变，获得了一系列亲和力不同的抗CXCR4变体，并在此基础上构建了一系列亲和力可调的双特异性抗CXCR4
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抗CD20变体及双特异性ADC。本专利技术的双特性抗CXCR4
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抗CD20变体在细胞内的内化不依赖于细胞表面的受体比率，在Ramous细胞中，抗CXCR4
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抗CD20和抗CXCR4
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抗CD20变体均能有效内化至细胞，且抗CXCR4
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抗CD20变体表现出比抗CXCR4
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抗RSV变体或抗CD20高得多的内吞率；亲和力减弱的抗CXCR4大大增强了双特异性抗CXCR4
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抗CD20变体ADC对Ramous(CXCR4+/CD20+)和Raji(CXCRR+/CD20+)细胞的毒性(与亲本双特异性ADC相比，在Ramous的毒性增强了近2倍，在Raji的毒性增强了3.6倍作用)；此外，亲和力减弱的双特异性抗CXCR4
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.结合CXCR4的单域抗体，所述单域抗体具有选自如SEQ ID NO.2
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SEQ ID NO.8之一的氨基酸序列。2.一种双特异性抗体，其包括a)第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含结合CXCR4的修饰的单域抗体，其中该单域抗体与其亲本抗体相比具有降低的对CXCR4的结合亲和力；b)第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域特异性结合肿瘤细胞表面抗原。3.权利要求2所述的双特异性抗体，其中所述修饰的单域抗体包含相对于SEQ ID NO:1具有一个或多个氨基酸置换、缺失、添加或插入的氨基酸序列，例如选自SEQ ID NOs:2
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8的任一序列。4.权利要求2或3所述的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合结构域与第一Fc融合，所述第二抗原结合结构域与第二Fc融合。5.权利要求4所述的双特异性抗体，其中所述第一Fc与所述第二Fc不同，且所述第一Fc与所述第二Fc各自包含减弱其自身形成同源二聚体的氨基酸置换。6.权利要求4所述的双特异性抗体，其中所述第一Fc和第二Fc具有如下的氨基酸置换：a)第一Fc包含根据Kabat编号的T350V，L351Y，F405A，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王峰，张雨菡，杜娟娟，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：