一种基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶及其制备方法与应用。本发明专利技术在聚合酶链式反应体系中掺入可配对的、碱基部分的5号位含炔丙氨基连接臂修饰的人工核苷酸，制备得到部分碱基上含氨基连接臂的核酸片段，先与点击化学接头反应，再分别与5'端含相应基团的引物进行点击化学反应，得到“毛刷”引物，最后以含有目的片段的环状DNA为模板，利用phi29 DNA聚合酶和所得引物进行滚环扩增，即可。本发明专利技术方法简易、普适性高，所得水凝胶具有较高稳定性、交联程度可控以及携带遗传信息等优点。由于毛刷引物RCA方法制备水凝胶可在30℃恒温下进行，无需热循环，这为细胞培养和酶的固定化提供了原位成胶的可能载体。的固定化提供了原位成胶的可能载体。的固定化提供了原位成胶的可能载体。

【技术实现步骤摘要】
一种基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物材料
，具体涉及一种基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]DNA是可编程的生物大分子，作为生命遗传分子引导生物发育和生命机能运作。从材料化学角度，DNA是一种天然的生物高分子，具有合成高分子无法比拟的特点。例如：碱基互补配对特性使DNA具有精准、高效的自组装能力；DNA序列多样可调，结构精准可控，具有丰富的刺激响应性；自然进化赋予生物体丰富多样的生物酶，可在分子水平对DNA进行精准操作；DNA具有良好的生物相容性和生物可降解性。
[0003]因为DNA的这些独特之处，近年来科学家们尝试将DNA作为构筑基元合成多种新型生物材料。其中，DNA水凝胶材料蓬勃发展。水凝胶是一类极为亲水的三维网络结构凝胶，与天然组织在物理性能、化学组成和力学方面性能相近，具有良好的生物相容性、可生物降解性和环境刺激响应性，在组织工程、生物传感器等生物医学领域具有广阔的应用前景。随着水凝胶领域研究的深入，更加精准的合成方法、更灵敏的刺激响应性以及更丰富的功能性已经成为新型应用型水凝胶开发过程中的主要研究方向和目标。DNA水凝胶既利用了水凝胶的骨架结构，也保留了DNA的生物功能，实现了水凝胶材料结构与功能的完美融合，在生物传感器、药物递送、细胞培养、蛋白质合成、智能器件、环境保护等领域表现出广泛的应用前景。
[0004]目前已经报道了若干制备DNA水凝胶的方法。例如，通过控制酶或pH将预先形成的DNA结构单元(X、Y、T型DNA)与互补的DNA链相互作用结合。也可以通过使用Y形DNA引物的PCR扩增或多引物滚环复制制备DNA水凝胶。但是，这些水凝胶是通过碱基之间的氢键结合而形成的，稳定性低，序列需要特殊的设计，并且很多性质(如疏密程度、机械性能等等)的可控性有限，极大地限制了DNA水凝胶的推广应用。
[0005]phi29 DNA聚合酶是来源于枯草芽孢杆菌噬菌体phi29的嗜温(30℃)DNA聚合酶，属于B型DNA聚合酶。2001年phi29 DNA聚合酶首次被用于等温多重引物滚环扩增(RCA)，利用phi29 DNA聚合酶特殊的链置换和连续合成特性，以环状DNA为模板，以短的与部分环状模板互补的DNA为引物，在phi29 DNA聚合酶的催化下，以dNTPs为原料合成单链DNA。该单链DNA产物包含多个串联重复序列的核酸片段，无需常规PCR所需的热循环步骤即可形成。等温多重引物滚环扩增方法具有高速、有效的特点，短时间内即可实现1万倍的扩增，可连续合成长达70kb的DNA片段。同时，phi29 DNA聚合酶具有3
’
到5
’
外切酶校正功能，因而错误率比标准的Taq聚合酶低1000倍。使用phi29 DNA聚合酶的多引物滚环扩增还具有能够产生双链产物的优点，使其应用于后续限制性内切酶消化或其他基因克隆、核酸标记和靶标检测的相关方法成为可能。
[0006]碱基修饰核酸含有修饰碱基，这些碱基大多是在天然碱基的不同部位进行化学修
饰后而形成的衍生物。相比天然核酸，某些碱基修饰核酸具有更高的稳定性和更加完善的性能，在生物工程、纳米技术和医学等领域具有巨大的应用潜力。

技术实现思路

[0007]为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶的制备方法。这是一种利用非天然核酸元件高效制备具有更加优良性质的核酸水凝胶的制备方法。
[0008]本专利技术的另一目的在于提供通过上述制备方法制得的非天然核酸水凝胶。
[0009]本专利技术的再一目的在于提供通过上述非天然核酸水凝胶的应用。
[0010]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0011]一种基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
[0012](1)上下游“毛刷”引物的制备：
[0013]a.在聚合酶链式反应体系中掺入可配对的、碱基部分的5号位含炔丙氨基连接臂的人工核苷酸，制备得到部分碱基上含氨基连接臂的核酸片段；
[0014]b.将步骤a所得核酸片段与点击化学接头反应，在核酸片段部分核苷酸上修饰接头；
[0015]c.根据目的片段的序列设计并合成分别与目的环状DNA两条链互补配对的上、下游引物，并将上、下游引物5'端修饰能与接头发生点击化学反应的基团；
[0016]d.将步骤b所得部分核苷酸上含接头的核酸片段，分别与步骤c所得5'端含修饰基团的上、下游引物进行点击化学反应，得到上、下游“毛刷”引物；
[0017](2)核酸水凝胶的制备：
[0018]以目的环状DNA为模板，利用phi29 DNA聚合酶和步骤(1)所得上游“毛刷”引物或下游“毛刷”引物或依次加入二者，进行滚环扩增(RCA)；扩增产物浓缩后高温退火，即得到所述的非天然核酸水凝胶。
[0019]步骤a中所述的聚合酶链式反应体系中的聚合酶可以是Taq聚合酶、OneTaq聚合酶、Q5聚合酶、KOD聚合酶、DeepVent聚合酶或SFM4
‑
3聚合酶中的任意一种；
[0020]当所述的聚合酶为SFM4
‑
3时，还可以在聚合酶链式反应体系中掺入可配对的、糖基部分的2号位点上含氟基团修饰的人工核苷酸，制备得到碱基上含氨基修饰同时糖基上含氟基团修饰的核酸片段，再进行后续反应。
[0021]当所述的聚合酶为SFM4
‑
3时，还可以在聚合酶链式反应体系中掺入非天然碱基对dTPT3和dNaM，制备得到含非天然碱基对的核酸片段，再进行后续反应。
[0022]当所述的聚合酶为SFM4
‑
3时，聚合酶链式反应体系中的核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸混合物，或核糖核苷酸混合物，或脱氧核糖核苷酸/核糖核苷酸混合物，制备得到相应的核酸片段，再进行后续反应。
[0023]步骤a中所述的掺入的方式可以是完全替代或部分替代天然核苷酸中的一种或多种，以最终得到的核酸片段中碱基上含氨基连接臂的核酸含量为10％～40％为优。
[0024]步骤a中所述的核酸片段中碱基上含氨基连接臂的核酸优选为间隔分布，更优选为等间隔分布，长度优选为50～200bp；更优选为70～100bp；最优选为75bp。
[0025]步骤b中所述的点击化学接头可选自NHS
‑
DBCO(二苯基环辛炔
‑
琥珀酰亚胺酯)接
头、NHS
‑
TCO(反式环辛烯
‑
琥珀酰亚胺酯)接头；优选为NHS
‑
DBCO接头。
[0026]步骤b中所述的核酸片段与点击化学接头的配比优选为摩尔比1:1000～1500；更优选为1:1000。
[0027]步骤b中所述的反应的条件优选为温度35～40℃、时间10～15h，更优选为温度37℃、时间12h。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)上下游“毛刷”引物的制备：a.在聚合酶链式反应体系中掺入可配对的、碱基部分的5号位含炔丙氨基连接臂的人工核苷酸，制备得到部分碱基上含氨基连接臂的核酸片段；b.将步骤a所得核酸片段与点击化学接头反应，在核酸片段部分核苷酸上修饰接头；c.根据目的片段的序列设计并合成分别与目的环状DNA两条链互补配对的上、下游引物，并将上、下游引物5'端修饰能与接头发生点击化学反应的基团；d.将步骤b所得部分核苷酸上含接头的核酸片段，分别与步骤c所得5'端含修饰基团的上、下游引物进行点击化学反应，得到上、下游“毛刷”引物；(2)核酸水凝胶的制备：以目的环状DNA为模板，利用phi29 DNA聚合酶和步骤(1)所得上游“毛刷”引物或下游“毛刷”引物或依次加入二者，进行滚环扩增；扩增产物浓缩后高温退火，即得到所述的非天然核酸水凝胶。2.根据权利要求1所述的基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的滚环扩增的具体操作如下：在1
×
phi29DNA聚合酶缓冲液中加入3～5μmol/L步骤(1)所得上游“毛刷”引物或下游“毛刷”引物将其退火到模板上，然后加入0.4～0.6mmol/L dNTPs、0.02～0.03mg/mL牛血清白蛋白和0.2～0.3U/μL phi29DNA聚合酶，30℃孵育10～15h；所述的退火的条件为95℃加热5min，逐渐冷却至室温后于冰上放置5min；步骤(2)中所述的浓缩的条件如下：5000～7000rpm转速下离心25～35min；步骤(2)中所述的高温退火的操作如下：在95℃加热5min后逐渐冷却至室温。3.根据权利要求1所述的基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的目的环状DNA长度为0～5000bp，进一步为100～3000bp。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤a中所述的聚合酶链式反应体系中的聚合酶为Taq聚合酶、OneTaq聚合酶、Q5聚合酶、KOD聚合酶、DeepVent聚合酶或SFM4
‑
3聚合酶中的任意一种。5.根据权利要求4所述的基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶的制备方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈庭坚，张汝洁，彭乐丽，叶方开，陈薛亦，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：