一种大豆真菌病害DNA提取方法技术

本发明专利技术公开了一种大豆真菌病害DNA提取方法，涉及分子生物学技术领域，实际操作时，在超净工作台中，用灭菌的接种刀刮取少量菌丝体，放入2ml无菌离心管中，加入2颗6mm无菌钢珠，加入500μL提取液，盖好管盖，上下摇晃试管大约8秒，得到匀浆组织；将纤维素试纸条浸入提取管中，上下蘸取三次，约3s，以结合核酸；将结合核酸的试纸条浸入装有1.75mL洗涤液的离心管中，上下蘸取三次，约3s；将结合有纯化DNA的试纸条浸入装有24μL扩增反应体系的PCR管中，上下蘸取三次，约3s，使DNA被洗脱到PCR体系中，待扩增。采用本发明专利技术中的大豆真菌DNA提取方法耗时更短，操作过程简便，专业要求低，适用于仪器条件不完善的口岸现场检测快速提取DNA。件不完善的口岸现场检测快速提取DNA。件不完善的口岸现场检测快速提取DNA。

【技术实现步骤摘要】
一种大豆真菌病害DNA提取方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及一种大豆真菌病害DNA提取方法。

技术介绍

[0002]大豆(学名：Glycine max(L.)Merr)是我国进口量最大、开放度最高的农产品，2013—2020年，我国大豆进口量由6 338万t增加到10 031万t，增幅达58.26％。随着进口量的增长，大豆携带的真菌病害入侵风险逐渐升高，口岸检疫鉴定工作面临严峻的挑战。现有大豆真菌的快速检测技术以常规聚合酶链式反应(PCR)及实时荧光PCR等分子生物学方法为主，这些方法都需要先获取大豆携带真菌的DNA。目前提取大豆真菌DNA最普遍的方法是CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后，加入乙醇沉淀分离核酸。但CTAB法提取DNA耗时长，需要2个多小时，其次操作也比较复杂，如：添加试剂多、操作步骤多以及需要仪器也多，无法满足口岸现场快速、高效、简便提取DNA的需求。
[0003]因此，目前亟需一种大豆真菌病害DNA提取方法，解决采用传统的CTAB法提取大豆真菌病害DNA耗时长、添加试剂多以及操作复杂的问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于：提供一种大豆真菌病害DNA提取方法，解决采用传统的CTAB法提取大豆真菌病害DNA耗时长以及操作复杂的问题。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0006]一种大豆真菌病害DNA提取方法，包括如下步骤：
[0007]S1、在超净工作台中，用灭菌的接种刀刮取500
‑
600mg菌丝体，放入2ml无菌离心管中；
[0008]S2、加入2颗6mm无菌钢珠，加入500μL提取液，盖好管盖，上下摇晃试管8
‑
10s，得到匀浆组织；
[0009]S3、将纤维素试纸条浸入提取管中，上下蘸取3
‑
4次，每次蘸取的时间为1
‑
2s，以结合核酸；
[0010]S4、将结合核酸的试纸条浸入装有1.75mL洗涤液的离心管中，上下蘸取3
‑
4次，每次蘸取的时间为1
‑
2s；
[0011]S5、将结合有纯化DNA的试纸条浸入装有24μL扩增反应体系的PCR管中，上下蘸取3
‑
4次，每次蘸取的时间为1
‑
2s，使DNA被洗脱到PCR体系中，待扩增。
[0012]优选的，所述提取液为20mM Tris[pH8.0]、25mM NaCl和2.5mM EDTA，0.05％ SDS。
[0013]优选的，所述洗涤液为10mM Tris[pH8.0]和0.1％吐温20mM。
[0014]优选的，所述扩增反应体系为10
×
PCR buffer 2.5μL、10mM dNTPs 0.3μL、10μM正反向引物各1μL、5U/μL TaqDNA聚合酶0.25μL和ddH2O 18.95μL。
[0015]与现有技术相比，本专利技术的有益效果：
[0016]首先，与采用CTAB法提取DNA相比，通过本专利技术提取真菌病害DNA所耗费的时间在5
‑
10分钟左右，其耗费的时间少；
[0017]其次，通过本方法对真菌病害DNA提取时，操作简单，所用的添加剂少，不需要使用组织粉碎仪、水浴锅和高速离心机等设备，专业要求低，适用于仪器条件不完善的口岸现场检测快速提取DNA。
附图说明：
[0018]图1为本专利技术PCR扩增产物中HIS3片段的电泳图；
[0019]图2为本专利技术PCR扩增产物中ITS片段的电泳图；
[0020]图3为本专利技术中LC8546的HIS3片段测序结果；
[0021]图4为本专利技术中LC8546的ITS片段测序结果；
[0022]图5为本专利技术中LC6173的HIS3片段测序结果；
[0023]图6为本专利技术中LC8206的HIS3片段测序结果。
具体实施方式
[0024]下面结合试验例及具体实施方式对本专利技术作进一步的详细描述。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本
技术实现思路
所实现的技术均属于本专利技术的范围。
[0025]实施例中提供了一种大豆真菌病害DNA提取方法，包括如下步骤：
[0026]采用PDA培养基培养3种大豆真菌，包括LC8546 Diaporthe phaseolorum、LC6173 Diaporthe helianthi、LC8206 Diaporthe sojae。
[0027]S1、在超净工作台中，用灭菌的接种刀刮取500
‑
600mg菌丝体，放入2ml无菌离心管中；
[0028]S2、加入2颗6mm无菌钢珠，加入500μL提取液(20mM Tris[pH8.0]，25mM NaCl，2.5mM EDTA，0.05％ SDS)，盖好管盖，上下摇晃试管大约8秒，得到匀浆组织；
[0029]S3、将纤维素试纸条浸入提取管中，上下蘸取三次，约3s，以结合核酸。
[0030]S4、将试纸条浸入装有1.75mL洗涤液(10mM Tris[pH8.0]，0.1％吐温20)的离心管中，上下蘸取三次，约3s。
[0031]S5、将结合有纯化DNA的试纸条浸入装有24μL灭菌水的PCR管中，上下蘸取三次，约3s，丢弃试纸。得到纯化的DNA。(若不需保存DNA，则直接将结合有纯化DNA的试纸条浸入装有24μL扩增反应体系(10
×
PCR buffer 2.5μL、10mM dNTPs 0.3μL、10μM正反向引物各1μL、5U/μL TaqDNA聚合酶0.25μL和ddH2O 18.95μL)的PCR管中，上下蘸取三次，约3s，丢弃试纸，待进行扩增。)
[0032]步骤中所述的纤维素试纸条制作过程为，Whatman No.1滤纸灭菌后，部分浸入熔化的Paraplast Plus石蜡中，蜡凝固后，将滤纸剪成44毫米宽的长方形，约40mm有蜡，4mm没有蜡。再剪成2mm宽的条形，形成2x4mm核酸结合区和2x40mm的石蜡防水手柄。
[0033]采用CTAB法提取大豆真菌病害DNA，具体步骤如下，
[0034]1、在超净工作台中，刮取适量菌丝于2ml离心管中。加入2
×
CTAB提取液300μL，加入4
‑
6颗小磁珠，在组织粉碎仪上，以60hz的速度粉碎40s，3次。
[0035]2、添加400μL的2
×
CTAB，混合均匀，60℃水浴保温30min，每15min震荡混匀一次。
[0036]3、加入700μL(等体积)氯仿：异戊醇(24:1)，充分混合均匀后室温静置5min，25℃，13000rpm，离心15min。轻轻取出，将上层清液550μL移入新的1.5ml离心管(凝固层上方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大豆真菌病害DNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、在超净工作台中，用灭菌的接种刀刮取500
‑
600mg菌丝体，放入2ml无菌离心管中；S2、加入2颗6mm无菌钢珠，加入500μL提取液，盖好管盖，上下摇晃试管8
‑
10s，得到匀浆组织；S3、将纤维素试纸条浸入离心管中，上下蘸取3
‑
4次，每次蘸取的时间为1
‑
2s，以结合核酸；S4、将结合核酸的试纸条浸入装有1.75mL洗涤液的离心管中，上下蘸取3
‑
4次，每次蘸取的时间为1
‑
2s；S5、将结合有纯化DNA的试纸条浸入装有24μL扩增反应体系的PCR管中，上下蘸取3
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：任荔荔，赵鹏，薛美玲，常亮，孔维恒，刘鑫，邱烨，王艺凯，
申请(专利权)人：中国海关科学技术研究中心，
类型：发明
国别省市：