靶向活化型肝星状细胞的核酸适配体APT-Tan的筛选方法技术

本发明专利技术提供一种靶向活化型肝星状细胞的核酸适配体APT

【技术实现步骤摘要】
靶向活化型肝星状细胞的核酸适配体APT
‑
Tan的筛选方法


[0001]本专利技术涉及生物医学领域，具体讲，涉及一种核酸适配体及其用途。

技术介绍

[0002]核酸适配体是利用指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment technology，SELEX)，在体外经过多轮筛选获得的、能够特异性识别靶物质的单链寡核苷酸。核酸适配体具有特异性高、亲和性高、稳定性强、易化学合成和化学修饰等诸多优点。目前核酸适配体作为一类新型的、广受关注的检测和治疗工具，在人类医学研究、疾病诊断、病毒侵染机制研究等领域展现出广阔的应用前景。近20年，大量与肿瘤以及其他疾病相关的重要分子的适配体已被筛选出来应用于生物医学基础研究、疾病诊疗和药物研发之中。Pegaptanib(商品名Macugen)是第一个被美国FDA批准上市用于治疗老年性黄斑变性的适配体药物。还有Aptamera公司研制的核酸适配体药物AS1411，经临床试验研究表明，AS1411对乳腺癌、宫颈癌等肿瘤细胞有较强的抑制作用。这些都表明核酸适配体具有很好的临床应用前景。在传统基础上发展起来的Cell
‑
SELEX技术，是将整个活细胞作为靶标来获取能与目的细胞相结合的适配体技术。该技术可以使细胞更接近自然状态，不仅可以获得未知目标信息的适配体，还可以区分细胞的某种状态，如分化或未分化细胞、正常细胞、癌细胞等。因此，该技术在肿瘤诊断、治疗和肿瘤标志物的发现方面具有巨大的应用潜力。
[0003]肝纤维化是以肝内结缔组织异常增生沉积为特征，是多种原因所致慢性肝病的共同病理改变。全球肝病的发病率正在增加，肝纤维化及其末期肝硬化在全世界构成巨大的卫生保健负担。2015年，全球约130万人死于慢性肝病(chronic liver disease，CLD)和肝硬化。CLD的病因包括慢性病毒性肝炎、酒精、非酒精性脂肪肝(non alcoholic fatty liver disease，NAFLD)、血色素沉着、α
‑1‑
抗胰蛋白酶缺乏、胆汁淤积和自身免疫性疾病。不论病因为何，未经治疗的CLD的最终结果是炎症、肝实质丧失、纤维化和再生愈合。肝星状细胞(HSC)是定位于肝脏窦周隙的非实质细胞，也曾叫作Ito细胞，贮脂细胞和维生素A储存细胞。在正常肝脏中，HSC处于静止状态，其特点是能够在细胞浆内的脂滴中储存视黄醇酯，并具有血管周细胞的超微结构特征。在肝损伤愈合过程中，尽管其他细胞也做出重要贡献，但关键的纤维化效应细胞类型是活化的HSC。多病因导致的肝损伤，使静止的HSC被激活，失去储存的维生素A，从而转化为α
‑
SMA表达阳性的肌成纤维细胞，进而分泌纤维胶原蛋白、弹性蛋白和基质蛋白，分泌促纤维化介质，导致肝纤维化。因此，采取切实可行的手段抑制HSC的活化被认为是阻止甚至逆转肝纤维化进程，达到预防、治疗肝硬化发生的关键。

技术实现思路

[0004]在本专利技术中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子生物学、核酸化学等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本专利技术，下面提供相关术语的
定义和解释。
[0005]如本文中所使用的，术语“生物分子”是指，存在于生物体中的分子的总称，包括但不限于，核酸、寡肽、多肽、纳米颗粒、糖类、脂质、和小分子化合物以及其任意的复合物。
[0006]术语“适配体”通常是指是一小段经体外筛选得到的能与蛋白质或代谢物等配体特异和高效结合的RNA或DNA片段。术语“肝纤维化”通常指的是一个病理生理过程，是指由各种致病因子所致肝内结缔组织的异常增生。
[0007]本专利技术的目的是提供一种新的核酸适配体，本专利技术提供的核酸适配体是外源合成的核苷酸链，其具有特异结合活化的HSC，并进入这种细胞的能力，所述细胞来源为肝星状细胞，肝脏正常细胞，及其他正常组织细胞。核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列为SEQ ID NO：1
‑
7所示的任一条DNA片段的核苷酸序列，所述核酸适配体能特异性进入活化HSC细胞。
[0008]所述用作标记的荧光为FAM。
[0009]作为优选方案本专利技术所述的核苷酸序列为SEQ ID NO：7所示的序列，即GGTTTGCTGT ATGGTGGGCG TTGAAAGAGG GGTGGACACG GTGG(SEQ ID NO：7)，命名为2(31
‑
74)，本专利技术所述的其为经SEQ ID NO：2截短后的。
[0010]所述适配体至少包括一个化学修饰：对所述适配体核酸序列中的磷酸二酯键的修饰，包括硫代化修饰；对所述适配体核酸序列中核糖的修饰，包括2
’‑
H被F、NH2、OMe的取代；对所述适配体核酸序列中的任意碱基进行氨基、羧基、巯基、生物素、胆固醇、聚乙二醇基团的修饰；对所述适配体的核苷酸序列中5
’
端的聚乙二醇(PEG)的修饰以及3
’
端的脱氧尿嘧啶(dU)、脱氧胸腺嘧啶(dT)以及脱氧次黄嘌呤(dL)的修饰；所述适配体的核苷酸序列中的至少一个核苷酸为锁核酸。
[0011]所述的核酸适配体在制备生物分子运输载体的药物上的应用，所述的生物分子包括核酸、寡肽、多肽、糖类、脂质、纳米颗粒、纳米嵌段或小分子化合物中的一种或任意的复合物，所述的核酸选自抗肝纤维化的si
‑
RNA、或Micro
‑
RNA。
[0012]本专利技术还提供了筛选所述核酸适配体的方法，其包括：筛选文库的选择，阴性和阳性筛选，PCR扩增及高通量分析，流式细胞术检测得到一条荧光量最强的适配体后，在该适配体基础上进行截短，最终获得最优适配体，包括如下步骤：
[0013](1)提供随机单链DNA文库，所述单链DNA文库包括下式表示的单链5'ATCCAGAGTGACGCAGCA(45N)TGGACACGGTGGCTTAGT3'，其中N45表示中间为45bp随机序列；以SEQ ID NO：8
‑
9所示的核苷酸序列的引物对制备次级文库；
[0014](2)单链DNA文库经变性后依次经正常肝脏其他细胞(肝细胞、肝窦内皮细胞、HSCs和枯否细胞)进行阴性筛选、活化HSC细胞进行阳性筛选，获得第一轮筛选产物；
[0015](3)以上游引物
‑
FAM、下游引物
‑
Biotin所示的核苷酸序列的引物对第一轮筛选产物进行PCR扩增，获得第二轮筛选产物；
[0016](4)以此类推，由上一轮核酸适配体文库经变性、正常肝脏其他细胞阴性筛选、HSC进行阳性筛选获得上一轮筛选产物，然后以步骤(1)所述引物对上一轮筛选产物进行PCR扩增获得下一轮核酸适配体文库，再进行下一轮筛选，共筛选11轮，最终获得核酸适配体，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.靶向活化型肝星状细胞的核酸适配体APT
‑
Tan的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）提供随机单链DNA文库，所述单链DNA文库包括下式表示的单链5'ATCCAGAGTGACGCAGCA(45N)TGGACACGGTGGCTTAGT3'，其中N45表示中间为45bp随机序列；以SEQ ID NO：8
‑
9所示的核苷酸序列的引物对制备次级文库；（2）单链DNA文库经变性后依次经正常肝脏细胞进行阴性筛选、活化HSC细胞进行阳性筛选，获得第一轮筛选产物，所述的正常肝脏细胞包括肝细胞、肝窦内皮细胞、HSCs和枯否细胞；（3）以SEQ ID NO：8
‑
9所示的核苷酸序列的引物对第一轮筛选产物进行PCR扩增，获得第二轮筛选产物；（4）依次类推，由上一轮核酸适配体文库经变性、正常肝细胞进行阴性筛选、HSC
‑
T6细胞进行阳性筛选获得上一轮筛选产物，然后以步骤(1)所述引物对上一轮筛选产物进行PCR扩增获得下一轮核酸适配体文库；共筛选12轮，筛选得到PCR扩增产物；将PCR扩增产物经双链DNA回收、亲和层析柱碱变性法分离单链DNA，获得18条核酸适配体序列；（5）将处于对数生长期的 HSC
‑
T6 细胞接种于 24 孔板中，质粒pcDNA3.1
‑
ALK5刺激HSC
‑
T6 活化，在细胞密度约 70%
‑
80%时，用 pcDNA3.1
‑
ALK5 处理细胞 24 h
‑
36 h，将18条核酸适配体序列与细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭勇，吴江锋，马岚，张瑞涛，倪毅然，
申请(专利权)人：三峡大学，
类型：发明
国别省市：