高效小体积核酸合成制造技术

本公开大体上涉及用于产生核酸分子的组合物和方法。在一些方面，本发明专利技术允许微量生成核酸分子，任选地接着将这些核酸分子组装成较大分子。在一些方面，本发明专利技术允许高效产生核酸分子(例如，大核酸分子，如基因组)。在一些方面，本发明专利技术涉及用于从合成核酸分子的微芯片的经流体填充的孔移出珠粒的方法。经流体填充的孔移出珠粒的方法。经流体填充的孔移出珠粒的方法。

【技术实现步骤摘要】
高效小体积核酸合成
[0001]本申请是CN201580076041.1的分案申请。


[0002]本公开大体上涉及用于产生核酸分子的组合物和方法。在一些方面，本专利技术允许微量生成核酸分子，任选地接着将这些核酸分子组装成较大分子，如美国申请第13/627,819号中所公开，所述参考文献以引用的方式特此并入。在一些方面，本专利技术允许高效产生核酸分子(例如，大核酸分子，如基因组)。

技术介绍

[0003]核酸分子的产生可相当简单或复杂，取决于如有待产生的核酸分子的类型等因素。举例来说，历史上，如引物等短的单链核酸分子已通常通过化学合成来生成(参见例如美国专利第5,837,858号，其公开内容以引用的方式并入本文中)。另外，较长核酸分子已通常通过聚合酶链反应(PCR)来生成。PCR的一个缺点是一般需要模板核酸。
[0004]许多核酸合成方法具有有限的大核酸分子从头生成的能力。本专利技术的一个方面是为了解决这一限制。
[0005]此外，用于基因合成的核酸分子通常是使用昂贵的自动化机器产生的，生产量有限。出于这个原因，正在研究替代性方法，如使用微阵列作为用于基因合成的核酸分子来源。微阵列可在小表面上具有数十万个不同的核酸分子并且可以极低的成本制造。
[0006]然而，基于微阵列的核酸分子合成方法可遭受如每一点产生的核酸分子量少等缺陷。这对于杂交分析用途可能不存在问题，杂交分析是最初开发二维微阵列的应用。然而，当二维微阵列用于基因合成(即，在平面表面上制造核酸分子)时，其可能缺乏至少两个重要特征。第一，核酸分子的数量可能不是大到足以组装片段，如可用于基因组装的片段。在某些情况下，仅可获得数阿托摩尔(attomole)。出于这个原因，所生成的核酸分子通常需要通过PCR复制以达到可用于片段组装的数量。此外，核酸分子的数量可因在合成之后可用于降解核酸分子的合成试剂(如酸)而进一步减少。
[0007]第二，难以从微阵列单独释放合成的核酸分子或释放于一个片段组装所需的池中。实际上，核酸分子通常被一起释放，常常产生具有数千个不同核酸分子的复杂池，在无后处理的情况下可能不适于基因合成。因此，为了利用这些池，常常需要像拨出PCR(dial
‑
out PCR)或测序等复杂方法以鉴别和扩增所期望的核酸分子。

技术实现思路

[0008]本专利技术部分涉及用于核酸分子合成的组合物和方法。本专利技术另外涉及用于获取合成的核酸分子的组合物和方法，以及用于组装核酸分子以形成如质粒、染色体和基因组等分子的组合物和方法。
[0009]在一些方面，本专利技术涉及用于无模板引导的核酸分子合成的多孔板。在一些实施例中，所述板包含位于所述板的多个孔的每一个中的珠粒(例如，磁性珠粒)和存在于所述
多个孔的一个或多个中的电化学生成酸(EGA)。替代在一个或多个孔中具有EGA或除了在一个或多个孔中具有EGA之外，板孔可含有在别处陈述的与核酸分子的合成相关联的其它试剂。在本文所公开的某些实施例中，光生酸(PGA)可替代EGA或除了EGA之外存在于多个孔的一个或多个中。EGA或PGA用于去除保护基(例如，DMT)，随后紧接着将酰胺添加到附接于固体支撑物的核酸分子。在一些实施例中，至少一种质子载体，如2
‑
氯
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甲基吡啶或二苯胺，可存在于具有EGA或PGA的溶液中。至少一种质子载体可通过接受来自EGA或PGA的质子，从而调节溶液的酸度来用于降低DNA降解的作用。
[0010]在一个方面，PGA用于生成经组装的核酸的方法中，所述方法包含a)合成多个核酸分子，其中每个核酸分子是在板或微芯片的孔中制备，其中所述孔可操作地连接到用于产生PGA的光源并且任选地含有质子载体，如2
‑
氯
‑6‑
甲基吡啶或二苯胺；b)组合(a)中生成的一些或全部核酸分子以产生池；c)接合(b)中所形成的池中所存在的一些或全部核酸分子以形成多个较大核酸分子；d)从(c)中所形成的多个较大核酸分子排除含有序列错误的核酸分子以产生经纠错的核酸分子池；和e)组装所述经纠错的核酸分子池中的核酸分子以形成所述经组装的核酸分子。用于本专利技术实践中的珠粒大小可大幅变化，但是包括直径在0.01μm与100μm之间、在0.005μm与100μm之间、在0.005μm与10μm之间、在0.01μm与100μm之间、在0.01μm与1,000μm之间、在1.0μm与2.0μm之间、在1.0μm与100μm之间、在2.0μm与100μm之间、在3.0μm与100μm之间、在0.5μm与50μm之间、在0.5μm与20μm之间、在1.0μm与10μm之间、在1.0μm与20μm之间、在1.0μm与30μm之间、在10μm与40μm之间、在10μm与60μm之间、在10μm与80μm之间或在0.5μm与10μm之间的珠粒。在某些实施例中，珠粒的直径可在30μm与40μm之间，如31μm或32μm或33μm或34μm或35μm的直径。所属领域的技术人员应认识到，当固体粒子降至低于特定大小时，它们开始获得流体属性(例如，形成胶态悬浮体的等效物)。因此，在一些情况下(例如，在使用直径小于约100nm的珠粒的情况下)，可能需要以流体形式处理珠粒。这可能意味着例如通过搅动、洗涤或通过使用表面活性剂从表面、孔或磁尖去除珠粒。
[0011]在本专利技术的特定实施例中，可依据孔的大小选择珠粒大小以使得仅一个单一珠粒占据孔。在其它实施例中，不止一个珠粒(或其它形状的核酸合成衬底)可在一些或全部孔中。在一些情况下，每孔的珠粒数可为一个、两个至二十个、两个至三十个、两个至十个、四个至二十个、四个至十个、四个至五十个等。
[0012]在某些实施例中，用于合成核酸的多孔板的每个孔被配置成容纳直径为约35
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40μm、或约35μm或约29至33μm的单分散珠粒。在某些实施例中，单分散珠粒是由合成聚合物(如聚苯乙烯)构成。
[0013]孔数也可大幅变化并且受以下因素限制，如有待产生的核酸量、时间限制、经济因素、技术因素(如可制造性)和与用途相关的机械因素(例如，(磁性)珠粒提取器的大小下限)。因此，依据各种因素而定，所期望的合成规模可变化并且可调节孔数以适应所期望的合成规模。在任何情况下，孔数可为例如10至10,000,000、10至5,000,000、10至2,000,000、10至1,000,000、10至800,000、10至650,000、10至500,000、500至500,000、500至200,000、10至50,000、1,000至500,000、10,000至500,000、20,000至500,000、1,000至50,000、10至50,000、10至25,000、10至10,000、10至5,000、10至2,500、100至50,000、100至25,000、100至10,000、100至5,000、100至2,500、350至50,000、350至25,000、350至10,000、350至本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于从合成核酸分子的微芯片的经流体填充的孔移出珠粒的方法，其中核酸分子附接到所述珠粒，所述方法包含：在排列于所述经流体填充的孔的底部的第一电极与第二电极之间提供电压，其中所述电压足以致使所述经流体填充的孔中的流体进行电解，在所述流体中产生一个或多个气泡以连同所述珠粒一起上升到所述经流体填充的孔的顶部。2.根据权利要求1所述的方法，其另外包含用珠粒收集装置收集已上升到所述经流体填充的孔的顶部的珠粒。3.根据权利要求1或2所述的方法，其另外包含将所收集的珠粒转移到第一多孔收集板的孔中。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其中所述流体包含水性或非水性缓冲溶液。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其中所述流体包含水、NaCl...

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：赛默飞世尔科技金尔特有限公司生命技术股份公司，
类型：发明
国别省市：