本发明专利技术提供了一种尿液中DNA的提取方法、试剂盒及基因标志物在制备诊断膀胱癌的试剂盒中的应用。其中，该提取方法包括：a)将尿液离心后获得尿沉渣，b)利用TE缓冲液洗涤尿沉渣，c)提取尿沉渣中DNA。能够解决现有技术中难以从尿液中提取大量DNA的问题，涉及生物样品中DNA提取领域。DNA提取领域。DNA提取领域。
【技术实现步骤摘要】
尿液中DNA的提取方法、试剂盒及基因标志物在制备诊断膀胱癌的试剂盒中的应用
[0001]本专利技术涉及生物样品中DNA提取领域，具体而言，涉及一种尿液中DNA的提取方法、试剂盒及基因标志物在制备诊断膀胱癌的试剂盒中的应用。
技术介绍
[0002]尿液可以作为癌症早期发现、复发监测效果的非侵入性方法，对于泌尿系肿瘤，尿液在很多情况下是首选的“液体活检”来源。尿液及膀胱在过去被认为是无菌的，但通过细胞培养或16S rDNA测序发现，尿液中有细菌存在，微生物群在泌尿生殖系统肿瘤中的作用是一个新兴的研究领域，值得进一步的研究。然而尿液中微生物的含量较少以及PCR抑制剂的存在会阻碍DNA的有效PCR扩增，用普通的微生物提取试剂盒很难提取足够的细菌DNA用于后续实验。另外基于多组学的研究，需要基于同一份尿液样本同时提取宿主基因组DNA和微生物DNA。
[0003]目前膀胱癌的诊断和监测方法主要是膀胱镜检查和尿脱落细胞学检查。膀胱镜检查具有侵入性；脱落细胞学检查取材繁琐，不易获得满意的标本，临床应用少。若有方便准确的生物标记方法，能够最大程度的推动膀胱癌诊断和复发进展的监测过程。
技术实现思路
[0004]本专利技术的主要目的在于提供一种尿液中DNA的提取方法、试剂盒及基因标志物在制备诊断膀胱癌的试剂盒中的应用，以解决现有技术中难以从尿液中提取大量DNA的问题。
[0005]为了实现上述目的，根据本专利技术的第一个方面，提供了一种尿液中DNA的提取方法，该提取方法包括：a)将尿液离心后获得尿沉渣，b)利用TE缓冲液洗涤尿沉渣，c)提取尿沉渣中DNA。
[0006]进一步地，c)包括：在利用TE缓冲液洗涤尿沉渣后，向尿沉渣中加入溶菌酶，孵育，以破坏细菌细胞壁；或向尿沉渣中加入玻璃砂，震荡，以破坏细菌细胞壁；优选地，TE缓冲液与尿液的体积比为1:10～30，更优选为1:20；优选地，对洗涤后的尿沉渣进行重悬，得到重悬液，将溶菌酶与重悬液按体积比1～2:3的比例混合，优选为体积比7:11，混合后置于35～37℃下处理30min～120min，优选45～60min。
[0007]进一步地，破坏细菌细胞壁后，使用DNA提取试剂盒，提取尿液中DNA；优选地，DNA提取试剂盒包括吸附柱、蛋白酶K、GB缓冲液、乙醇、GD缓冲液、PW漂洗液；优选地，尿液中DNA包括尿液微生物DNA和宿主DNA。
[0008]进一步地，提取方法还包括：设置空白对照的步骤；优选地，按如下方法设置空白对照：向空白对照管中加入含有核酸助沉剂或糖原的无菌水；更优选地，无菌水中核酸助沉剂或糖原的体积含量为0.5～1.5％。
[0009]为了实现上述目的，根据本专利技术的第二个方面，提供了一种检测试剂盒，检测试剂盒包括检测尿沉渣中DNA含量的试剂。
[0010]进一步地，检测尿沉渣中DNA含量的试剂为检测尿沉渣中微生物DNA含量的试剂；优选地，检测尿沉渣中微生物DNA含量的试剂为检测尿沉渣中微生物DNA含量的特异性序列拷贝数的试剂；更优选地，特异性序列选自SEQ ID NO:1。
[0011]进一步地，检测拷贝数的检测试剂包括构建测序文库的相关试剂或PCR扩增检测相关试剂；优选地，构建测序文库的相关试剂包括构建二代测序文库的相关试剂，更优选为构建宏基因组测序文库的相关试剂；优选地，PCR扩增检测相关试剂包括实时荧光定量PCR的相关试剂；优选地，试剂包括SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
[0012]为了实现上述目的，根据本专利技术的第三个方面，提供了一种检测尿液DNA的方法，该方法包括：利用上述提取方法提取尿液DNA，对尿液DNA中的靶标基因进行检测；优选地，采用上述检测试剂盒进行检测；更优选地，采用SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列对SEQ ID NO：1的靶标基因进行实时荧光定量PCR检测。
[0013]为了实现上述目的，根据本专利技术的第四个方面，提供了一种基因标志物在制备诊断膀胱癌的试剂盒中的应用，其中，基因标志物为具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的基因。
[0014]进一步地，应用包括对尿液DNA中的基因标志物进行定性和/或定量检测；利用上述提取方法提取尿液DNA；优选地，采用构建测序文库或实时荧光定量PCR的方法，对基因标志物进行定性和/或定量检测；更优选地，采用SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，对基因标志物进行定性和/或定量检测。
[0015]应用本专利技术的技术方案，将尿液离心后获得尿沉渣，利用TE缓冲液洗涤尿沉渣，从而大量提取其中的DNA，提高了DNA的提取效率，减少后续PCR扩增抑制。
附图说明
[0016]构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：
[0017]图1示出了根据本专利技术的实施例2的病人和正常人两组数据的分散情况示意图；
[0018]图2示出了根据本专利技术的实施例2的ROC曲线示意图。
具体实施方式
[0019]需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本专利技术。
[0020]如
技术介绍
所提到的，尿液中微生物的含量较少以及PCR抑制剂的存在会阻碍DNA的有效PCR扩增，用普通的微生物提取试剂盒很难提取足够的细菌DNA用于后续实验。另外基于多组学的研究，需要基于同一份尿液样本同时提取宿主基因组DNA和微生物DNA。而利用现有技术对于尿液样本中的DNA进行提取，提取的DNA中多为宿主基因组DNA，而微生物DNA较少，难以满足多组学研究的需求。
[0021]因而，在本申请中专利技术人尝试利用TE缓冲液洗涤尿沉渣后提取其中的DNA，经试验验证发现该方法能够大量提取尿液中的DNA，提出了本申请的一系列保护方案。
[0022]在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种尿液中DNA的提取方法，该提取方法包括：a)将尿液离心后获得尿沉渣，b)利用TE缓冲液洗涤尿沉渣，c)提取尿沉渣中DNA。
[0023]尿沉渣是尿液中的有形状成分，是尿液经过离心后形成的沉渣，包括细胞、细菌、结晶等有形成分。通过离心尿液获得尿沉渣后，在提取尿沉渣中DNA前，先利用TE缓冲液对尿沉渣进行洗涤，能够去除尿沉渣中的结晶等杂质。在本申请中，专利技术人发现尿中结晶多为盐结晶，结晶越多越干扰DNA的提取，导致提取的量越少。减少杂质成分对DNA提取和后续检测的影响，提高DNA提取效率。
[0024]在一种优选的实施例中，c)包括：在利用TE缓冲液洗涤尿沉渣后，向尿沉渣中加入溶菌酶，孵育，以破坏细菌细胞壁；或向尿沉渣中加入玻璃砂，震荡，以破坏细菌细胞壁；优选地，TE缓冲液与尿液的体积比为1:10～30，更优选为1:20；优选地，对洗涤后的尿沉渣进行重悬，得到重悬液，将溶菌酶与重悬液按体积比1～2:3的比例混合，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种尿液中DNA的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括：a)将尿液离心后获得尿沉渣，b)利用TE缓冲液洗涤所述尿沉渣，c)提取所述尿沉渣中DNA。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述c)包括：在利用所述TE缓冲液洗涤所述尿沉渣后，向所述尿沉渣中加入溶菌酶，孵育，以破坏细菌细胞壁；或向所述尿沉渣中加入玻璃砂，震荡，以破坏所述细菌细胞壁；优选地，所述TE缓冲液与所述尿液的体积比为1:10～30，更优选为1:20；优选地，对洗涤后的所述尿沉渣进行重悬，得到重悬液，将所述溶菌酶与所述重悬液按体积比1～2:3的比例混合，优选为体积比7:11，混合后置于35～37℃下处理30min～120min，优选45～60min。3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，破坏所述细菌细胞壁后，使用DNA提取试剂盒，提取所述尿液中DNA；优选地，所述DNA提取试剂盒包括吸附柱、蛋白酶K、GB缓冲液、乙醇、GD缓冲液、PW漂洗液；优选地，所述尿液中DNA包括尿液微生物DNA和宿主DNA。4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述提取方法还包括：设置空白对照的步骤；优选地，按如下方法设置所述空白对照：向空白对照管中加入含有核酸助沉剂或糖原的无菌水；更优选地，所述无菌水中所述核酸助沉剂或糖原的体积含量为0.5～1.5％。5.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括检测尿沉渣中DNA含量的试剂。6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测尿沉渣中DNA含量的试剂为检测尿沉渣中微生物DNA含量的试剂；优选地，所述检测尿沉渣中微生物DNA含量的试剂...
【专利技术属性】
技术研发人员：李南南，杨琴，吴逵，林从，李甫强，罗甜，罗慧娟，赵鑫，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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