常见皮肤癣菌的快速多重检测方法技术

本发明专利技术公开了用于快速鉴定多种皮肤癣菌的引物组。基于k

【技术实现步骤摘要】
常见皮肤癣菌的快速多重检测方法


[0001]本专利技术涉及分子检测领域，具体涉及用于快速鉴定红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)，须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)，以及犬小孢子菌(Microsporumcanis)的引物组及其应用。

技术介绍

[0002]皮肤癣菌病主要致病菌是皮肤癣菌，包括毛癣菌属、小孢子菌属和表皮癣菌属3个属，其共同特点是亲角质蛋白，侵犯人和动物的皮肤、毛发、甲板，引起感染。皮肤癣菌的种类有40多种，最常见的是毛癣菌属的红色毛癣菌和须癣毛癣菌，以及小孢子菌属的犬小孢子菌等。皮肤癣菌具有很强的传染性，可以在人与人,动物与人,污染物与人之间传播。足癣是最常见的皮肤真菌感染,从行病学调查数据来看,全球自然人群发病率在10％以上。可因混穿鞋袜,裸足在公共浴室、健身房、游泳池等场所行走,密切接触病原菌而被感染。此外，随着家庭饲养宠物的增多，感染动物源性的体癣患者也随之增加(以犬小孢子菌感染最为多见)。
[0003]皮肤癣菌对患者的健康、工作、社交及日常生活有明显的影响,如超过半数的患者因为瘙痒而影响睡眠甚或工作及生活。甲癣(俗称灰指甲)可以引起疼痛或引发甲沟炎，甚至会因甲的异常形态影响正常的社会交往。年老者及免疫力低下人群感染皮肤癣菌如果长期未获得有效治疗可能发展成癣菌疹，又因皮肤屏障的破坏继发细菌感染、形成丹毒、蜂窝织炎以及皮肤溃烂，造成严重的不良后果。因此，积极诊治皮肤癣菌病具有重要的临床价值和社会价值。
[0004]皮肤癣菌随着地理环境和社会经济条件而演变。一个世纪前，絮状表皮癣菌是浅表真菌病的最主要病原体，但自20世纪中期以来，它的发病率急剧下降，目前仅限于一些欠发达国家。同时，红色毛癣菌、须癣毛癣菌和小孢子菌的频率逐渐增加，这些真菌已成为全球的主要种类。目前，红色毛癣菌是皮肤和指甲真菌感染的主要病原体，而小孢子菌是头癣的主要皮肤真菌。此外，红色毛癣菌和须癣毛癣菌对特比萘芬和氟康唑等药物的耐药的报道越来越多。区分皮肤癣菌的种类对不同类型的皮肤癣菌病的治疗方案和药物的选择具有一定的指导作用。
[0005]另一方面，造成皮肤病的因素多种多样，皮肤癣菌只是其中常见的一种，部分患者临床表现与湿疹、神经性皮肤、汗疱疹等疾病的症状类似，无法仅凭临床表现来判断。部分医生对此病缺乏与其他皮肤病鉴别诊断的经验,误诊误治时有发生,以致临床上误用或滥用糖皮质类固醇激素制剂而导致皮肤真菌感染的扩散。针对皮肤癣菌的实验室检测是确诊该病必不可少的诊断手段。
[0006]目前，皮肤癣菌的常规实验室检测方法包括真菌镜检和真菌培养。真菌镜检指用显微镜直接观察临床样本寻找皮肤癣菌，检出率较低。而真菌培养是指提供合适的生长条件和生长介质帮助临床样本中的皮肤癣菌大量繁殖，从而能够在显微镜下更容易看到。整个过程耗时长(需要2
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6周)，同时培养环境需要严格控制，容易造成致病皮肤癣菌难以繁殖
或者环境真菌大量繁殖引起污染，从而严重影响结果的准确性。另外，两种方法都需要利用显微镜，凭借检测人员的经验对真菌的形态进行比较判断给出诊断结果，因此高度依赖于操作人员的临床经验和每次真菌培养的实际效果。由此可见，目前临床上的检测方法难以满足临床诊断时效性和可靠性要求。
[0007]近年来分子生物学诊断也不断应用于临床研究。这项技术是基于真菌的特异基因序列而不是形态差别，因此具有特异性高，无需人工解读的特点。同时由于使用PCR(聚合酶链式反应)技术对基因进行极高倍数扩增，使得未经培养的微量真菌也有可能被检测到，大大节省了检测时间。尽管如此，分子诊断用于真菌检测还存在一系列问题，影响了它的临床应用，包括临床标本中真菌核酸难以提取(皮肤癣菌为丝状真菌，细胞壁含有丰富的几丁质，细胞壁不易破裂)，不同种真菌序列存在相似性难以区分等。这些都使得目前市场上没有用于皮肤癣菌的分子诊断产品。
[0008]基于皮肤癣菌的高发病率和临床诊断的需求，以及日益增长的宠物市场，开发皮肤癣菌的分子诊断试剂具有可观的社会价值和经济价值。本专利主要针对人和宠物相关皮肤癣菌病中最重要的3种致病菌(包括红色毛癣菌、须癣毛癣菌和小孢子菌)进行检测，能够对大多数皮肤癣菌病筛查出明确的病原体。本专利涉及的检测方法不仅有助于提高皮肤癣菌病的诊断水平、避免漏诊和误诊，同时还为医师的治疗方案提供依据、指导临床合理的用药。
[0009]实现皮肤癣菌多重分子检测的难点是多方面的。真菌的分子检测一般是基于真菌基因组里的位于几个核糖体RNA基因之间的ITS(Internal transcribed spacer)序列。这些序列在每个基因组里有多达成百上千个拷贝。相对于每个基因组一般只有两个拷贝的其它基因，检测ITS序列能大大提高信号以及灵敏度。另一方面，不同真菌物种的ITS序列之间存在一定差异。这也是利用ITS序列进行物种鉴定的分子基础。然而，真菌的ITS序列很短，一般只有400
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700个碱基对的长度，而一个PCR检测反应就需要100个碱基对左右。再加上真菌的种类繁多，有记录的就有近15万种，并且彼此之间存在关联，使得ITS序列在不同真菌之间存在一定相似性。因此，要在700个碱基对以内设计出多个分子检测反应，来从十几万种可能性中特异性的检测出几种常见皮肤癣菌，而且彼此之间还不能互相干扰，难度非常大。也造成了目前没有针对皮肤癣菌的多重检测技术的局面。
[0010]PCR是一种常用分子生物学技术，可用于将微量目标核酸序列(例如待测基因序列)扩增至可检测的量。其原理是利用能识别目标序列的DNA引物与目标特异性结合，并在DNA聚合酶的作用下对目标序列进行指数级复制和扩增。在分子诊断中常用的荧光定量PCR则在普通PCR的基础上引入荧光标记的探针，利用在扩增过程中产生的荧光信号对目标序列进行实时检测和定量。在多重定量PCR技术中，针对不同的靶标采用各自特异的荧光探针并携带不同颜色的荧光标记，使得多个靶标可以被同时检测。

技术实现思路

[0011]现有技术中关于真菌的基因检测的报道大部分是针对单一菌种的检测，而临床上需要同时检测多种常见皮肤癣菌。使用单通量、一个反应检测一种真菌的方法需要的试剂，耗材，人工都成倍的增长。因此临床上急需多重检测技术实现一个反应检测多个常见皮肤癣菌。
[0012]为了解决这个问题，本专利技术人通过生物信息学手段建立了序列分析算法，利用高性能计算机分析海量现有真菌基因组序列，从中搜索在目标物种里普遍存在，而其它物种中不存在或者差异很大的ITS序列。利用这些序列设计出针对几种常见皮肤癣菌的分子检测方法，并在实际真菌样品上进行测试验证。经过多轮序列搜索和实验验证最终得到优化的多重检测方法，能在一个反应里高灵敏和高特异的同时检测出多种常见皮肤癣菌。
[0013]针对临床上皮肤癣菌的发生情况，选择了三种常见皮肤癣菌作为临床诊断的目标物种：红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)，须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于快速鉴定多种皮肤癣菌的引物组，所述皮肤癣菌分别为红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)，须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)，以及犬小孢子菌(Microsporumcanis)，其特征在于，鉴定红色毛癣菌的引物如SEQ ID NO.13
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14所示，鉴定须癣毛癣菌的引物如SEQ ID NO.22
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23所示，鉴定犬小孢子菌的引物如SEQ ID NO.37
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38所示。2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，还包括真菌通用扩增引物，其特征在于，所述真菌通用扩增引物如SEQ ID NO.46
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47所示。3.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，还包括探针，其中结合红色毛癣菌的探针序列如SEQ ID NO.15所示，结合须癣毛癣菌的探针序列如SEQ ID NO.24所示，结合犬小孢子菌的探针序列如SEQ ID NO.39所示，用于真菌通用的探针如SEQ ID NO.48所示。4.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述探针采用荧光基团标记。5.根据权利要求4所述的引物组，其特征在于，所述荧光标记基团选自FAM、HEX、BHQ、Texas Red以及Cy5。6.权利要求1
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5任一权利要求所述引物组的扩增方法，其特征在于，所述方法的扩增条件为：1)95℃，1分钟；2)4...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹泽晖，莫小辉，宋佳，谭蔚泓，鞠强，孙迪，田瑞，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：