一种鉴别蜜柚栽培品种的引物组、试剂盒及鉴别方法技术

本发明专利技术一种鉴别蜜柚栽培品种的引物组、试剂盒及鉴别方法，涉及分子标记技术领域。本发明专利技术基于全基因组重测序结果，开发了多态性良好的InDel标记引物，引物使用其中任意1对便可将2个主栽品种在早期进行区别，检出率为92.31

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别蜜柚栽培品种的引物组、试剂盒及鉴别方法
[0001]本专利技术为专利：一种鉴别井冈蜜柚栽培种类型的引物组、试剂盒及鉴别方法的分案申请，原申请的申请日为：2022年02月22日，申请号为：202210163279.X，专利名称为：一种鉴别井冈蜜柚栽培种类型的引物组、试剂盒及鉴别方法。


[0002]本专利技术属于分子标记
，具体涉及一种鉴别井冈蜜柚苗木品种的引物组、试剂盒及鉴别方法。

技术介绍

[0003]井冈蜜柚是指以“井冈山”为品牌，在江西省吉安市生产栽培的甜柚品种的统称，为我国地理标志性农产品，是吉安重点支持发展的六大富民产业之一，也是江西省果业三大金字招牌之一。到目前为止，井冈蜜柚种植面积已达40余万亩，有3个主栽品种，分别为金沙柚、金兰柚和桃溪蜜柚，据统计，截至2020年年底，前两个品种种植面积达井冈蜜柚总面积的71.27％，是主导品种，桃溪蜜柚种植面积占13.39％。桃溪蜜柚是沙田柚在江西的变种，其成熟期早且果实特征显著，易与其他两个井冈蜜柚品种鉴别。但是，因为金沙柚是金兰柚和沙田柚的杂交后代，这两个井冈蜜柚品种亲缘关系很近，仅凭形态特征很难区别。在井冈蜜柚快速发展的过程中，金兰柚和金沙柚2个主栽品种被混淆，导致生产上苗木混乱，品种名称错用，严重影响了该产业的健康可持续发展。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种鉴别井冈蜜柚栽培种类型的引物组、试剂盒及鉴别方法，可将2个主栽品种有效区别，为井冈蜜柚品种早期精准鉴别提供了依据，为生产上澄清品种名称发挥了积极作用。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种鉴别井冈蜜柚栽培种类型的引物，所述引物组包括PA1、PA2、PA3、PA4、PA5、PA6、PA7和PA8中任意1对或多对的组合；各引物的序列如表1所示：
[0007]表1引物组的序列
[0008][0009]本专利技术基于全基因组重测序结果，开发上述8条多态性良好的InDel标记引物，这8对引物使用任意1对便可将2个主栽品种区别开，为井冈蜜柚品种早期精准鉴别提供了依据，为生产上澄清品种名称发挥了积极作用。本专利技术所述井冈蜜柚栽培种优选包括金兰柚柚和金沙柚，其中金沙柚是金兰柚(母本)和沙田柚(父本)的杂交后代，金沙柚为子代。
[0010]本专利技术对所述引物组的获取方法并没有特殊限定，优选取幼嫩叶片置于液氮中研磨后提取基因组总DNA，获得的原始数据经过FastQC进行质量评估，利用Fastp软件去除接头序列和进行数据质控，以晚白柚(Citrus maxima(Burm.)Merr.cv.Wanbai)(website：http://citrus.hzau.edu.cn/orange/download/index.php)为参考基因组建立索引，运用BWA软件将测序得到的片段与参考基因组序列进行比对，通过GATK进行InDel检测和过滤。利用严格的参数进行InDel标记筛选(Simona et al.，2017)：(1)变异位点的QUAL大于400；(2)变异位点的GQ值为99；(3)覆盖深度大于20；(4)InDel插入或者缺失的长度在5
‑
8bp之间。根据参考基因组注释筛选出变异位置侧翼序列信息，利用Primer3.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3/)设计InDel标记的扩增引物。然后使用e
‑
PCR进行引物特异性检测，最终选择8对具有特异性的InDel标记扩增引物。
[0011]本专利技术还提供了一种包含上述引物组的鉴定井冈蜜柚栽培种类型的试剂盒。
[0012]本专利技术所述试剂盒优选还包括PCR反应试剂，如Mix液和/或ddH2O。
[0013]本专利技术还提供了一种鉴别井冈蜜柚栽培种类型的方法，包括以下步骤：以井冈蜜柚栽培种的基因组DNA为模板DNA，利用上述引物进行PCR扩增，当扩增产物只有一条带时是
纯合，该品种为父本沙田柚或母本金兰柚；有两条或两条以上带时为杂合，该品种为子代。
[0014]具体到本专利技术中，以母本金兰柚、父本沙田柚和子代金沙柚基因型为参照，根据其样品基因型判定品种类型。与母本基因型一致的记录为1，该品种为金兰柚；与父本基因型一致的记录为2，该品种为沙田柚；与子代基因型一致的记录为3，该品种为金沙柚；其它基因型的记录为4，为其他品种；基因型缺失记录为0。
[0015]本专利技术所述引物组或试剂盒可应用于早期鉴别，利用幼树的幼嫩叶片即可，因此所述基因组DNA优选提取自幼嫩叶片。本专利技术对所述基因组DNA的提取方法并没有特殊限定，优选利用CTAB法或试剂盒法。
[0016]本专利技术所述PCR扩增的体系以15μl计，优选包括：7μl的Mix液，0.3μl的10mmol/L的正向引物，0.3μl的10mmol/L的反向引物，1.5μl的模板DNA和余量的ddH2O。本专利技术所述PCR扩增的程序，优选包括94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，反应进行35个循环；72℃再延伸5min。
[0017]利用本专利技术所述引物组或试剂盒进行所述鉴别时，优选经过至少两轮PCR鉴定，而后利用琼脂糖凝胶电泳，保留胶图清晰并且大小与预测完全一致的引物，引物扩增可见两条带，表明该位点为杂合，且存在胶图可分辨的大小差异，即可确定为可以使用的具有良好效果的标记。本专利技术所述琼脂糖凝胶电泳优选采用1.5％
‑
2％质量百分比的琼脂糖凝胶，电压120V，电泳15
‑
20min。
[0018]有益效果：本专利技术基于全基因组重测序结果，开发了8条多态性良好的InDel标记引物，这8对引物使用其中任意1对对便可将2个主栽品种在早期进行区别，为井冈蜜柚品种早期精准鉴别提供了依据，为生产上澄清品种名称发挥了积极作用。
附图说明
[0019]图1为PA1和PA2的特异性验证图；各图中，第1，2泳道是母本金兰柚，第3泳道是子代金沙柚，第4，5泳道是父本沙田柚，其余为井冈蜜柚产区栽培品种，下同；
[0020]图2为PA3和PA4的特异性验证图；
[0021]图3为PA5和PA6的特异性验证图；
[0022]图4为PA7和PA8的特异性验证图。
具体实施方式
[0023]下面结合实施例对本专利技术提供的一种鉴别井冈蜜柚栽培种类型的引物组、试剂盒及鉴别方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。
[0024]实施例1
[0025]委托北京擎科生物科技有限公司合成表1所示的引物。
[0026]材料：提取蜜柚树体幼嫩叶片基因组DNA。
[0027]PCR反应体系为15μl：7μl的Mix液，0.3μl的10mmol/L的正向引物，0.3μl的10mmol/L的反向引物，1.5μl的100ng/μl模板DNA和6μl的ddH2O。
[0028]PCR扩增程序为：94本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴别井冈蜜柚栽培种类型的引物组，其特征在于，所述引物组包括PA6、PA7、PA8中的任意1对或多对的组合；所述PA6包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的PA6
‑
F和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的PA6
‑
R；所述PA7包括核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的PA7
‑
F和核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的PA7
‑
R；所述PA8包括核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的PA8
‑
F和核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的PA8
‑
R。2.根据权利要求1所述引物组，其特征在于，所述井冈蜜柚栽培种包括金兰柚和金沙柚。3.一种包含权利要求1或2所述引物组的鉴定井冈蜜柚栽培种类型的试剂盒。4.根据权利要求3...

【专利技术属性】
技术研发人员：王雨亭，胡钟东，万水林，杨惠栋，汤雨晴，徐超，刘心澄，
申请(专利权)人：江西省农业科学院园艺研究所，
类型：发明
国别省市：