一种双环吉玛烯合成酶突变体和基因序列以及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种双环吉玛烯合成酶突变体和基因序列以及应用。所述双环吉玛烯合酶突变体包括以SEQ ID NO.1所示野生型的双环吉玛烯合成酶核苷酸序列为模板，第290位异亮氨酸突变为缬氨酸形成的突变体I290V；第316位异亮氨酸突变为亮氨酸形成的突变体I316L；第454位亮氨酸突变为半胱氨酸形成的突变体L454C；第290位异亮氨酸突变为缬氨酸，第316位异亮氨酸突变为亮氨酸，以及第454位亮氨酸突变为半胱氨酸形成的组合突变体I290V/I316L/L454C。本发明专利技术通过酶工程手段改造双环吉玛烯合成酶以提高双环吉玛烯的产量，为萜烯合酶类的改造提供了参考，具有重要的生产意义和实际的应用价值。值。值。

【技术实现步骤摘要】
一种双环吉玛烯合成酶突变体和基因序列以及应用


[0001]本专利技术属于酶基因工程及酶工程领域，具体涉及一种来源于马鞭草(Lippia dulcis)的双环吉玛烯合成酶LdTPS5突变体及其编码基因以及应用。

技术介绍

[0002]双环吉玛烯是一种重要的双环倍半萜，是雄性激素(androgen)、雌性激素(estrogen)、孕酮(progesterone)和多巴胺(dopamine)等人体激素的潜在受体，有治疗内分泌疾病的潜力。双环吉玛烯可能是具有抑菌活性的香橙烯、白千层醇、蓝桉醇、喇叭醇和喇叭茶醇(palustrol)等香橙烯型倍半萜合成的重要中间体，也可能是一些具有抑菌活性的杂环萜如psiguadials A和macrocarpal A的重要合成骨架。目前，双环吉玛烯合成酶的催化效率以及特异性催化限制了双环吉玛烯的利用，因此通过酶工程手段对双环吉玛烯合成酶进行改造以提高双环吉玛烯产量具有重要的生产意义和应用价值。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于，提供一种双环吉玛烯合成酶LdTPS5突变体及其基因序列，以解决双环吉玛烯合成酶的催化效率低以及产物特异性差导致的双环吉玛烯产量低的问题。
[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0005]根据本专利技术的第一方面，提供一种双环吉玛烯合成酶突变体，所述双环吉玛烯合成酶突变体包括以SEQ ID NO.1所示野生型的双环吉玛烯合成酶核苷酸序列为模板，分别进行四个位点突变，获得四个突变体，所述四个突变体为：第290位异亮氨酸突变为缬氨酸形成的突变体I290V，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；第316位异亮氨酸突变为亮氨酸形成的突变体I316L，其氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；第454位亮氨酸突变为半胱氨酸形成的突变体L454C，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；第290位异亮氨酸突变为缬氨酸，第316位异亮氨酸突变为亮氨酸以及第454位亮氨酸突变为半胱氨酸形成的组合突变体I290V/I316L/L454C，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0006]根据本专利技术的第二方面，提供一种双环吉玛烯合成酶突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因编码如上所述的任意一种双环吉玛烯合成酶突变体的氨基酸序列。
[0007]根据本专利技术的第三方面，提供一种包含所述双环吉玛烯合成酶突变体的编码基因的重组表达载体。
[0008]根据本专利技术的一个优选实施方案，所述重组表达载体中的载体质粒为pESC
‑
URA，启动子为Gal1诱导性启动子。但是应当理解的是，本专利技术并不仅限于该载体质粒和启动子，还可以是其他任何适合的载体质粒和启动子。
[0009]根据本专利技术的第四方面，提供一种如上所述的双环吉玛烯合成酶突变体的编码基因的重组基因工程菌。
[0010]根据本专利技术的第五方面，提供一种所述双环吉玛烯合酶突变体在酵母中合成双环吉玛烯中的应用。
[0011]所述应用包括：将一种包含所述双环吉玛烯合酶突变体的编码基因的重组表达载体转入酵母宿主菌中，将所述重组基因工程菌接种到尿嘧啶缺陷型选择性培养基中发酵120h，从而获得包含双环吉玛烯的产物。
[0012]在所述应用中，优选地，在24h时添加终浓度为10g/L的半乳糖进行蛋白的诱导表达，同时添加10％正十二烷进行双相发酵培养以减少双环吉玛烯的损失。
[0013]有益效果：本专利技术通过理性设计改造初步获得了4种双环吉玛烯合酶突变体，I290V，I316L，L454C以及组合突变体I290V/I316L/L454C，并通过基因工程技术进一步构建出基因重组酵母菌株，最终通过实验证明，相比野生型菌株，突变体菌株生产双环吉玛烯的产量分别提高了17.6，11.2，12.3和52.7倍。
[0014]综上所述，本专利技术利用基因工程和酶工程的手段，提供了一种双环吉玛烯合酶突变体以及在酵母中合成双环吉玛烯的应用，通过提供催化活性提高的双环吉玛烯合酶突变体，提高双环吉玛烯的产量，为双环吉玛烯的工业化生产创造了条件。
附图说明
[0015]图1为双环吉玛烯合成酶LdTPS5的三维结构模型图；
[0016]图2示出了双环吉玛烯合成酶LdTPS5的基因表达载体的质粒示意图；
[0017]图3示出了基因重组酵母菌株的双环吉玛烯产量图。
具体实施方式
[0018]以下结合具体实施例，对本专利技术做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限制本专利技术的范围。
[0019]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。引物和序列为金唯智生物科技有限公司合成。
[0020]实施例1双环吉玛烯合成酶三维结构模型的建立
[0021]利用同源建模工具，以PDB ID：3G4F为参考模型对双环吉玛烯合成酶进行同源建模。经模型评估后，获得可靠的三维结构模型，三维结构模型图如图1所示。
[0022]实施例2构建双环吉玛烯合成酶突变体
[0023]首先，委托金唯智公司合成经过密码子优化过的LdTPS5(该密码子优化后的核苷酸序列如序列SEQ ID No.1所示)。利用PCR技术，以合成的LdTPS5为模板，对LdTPS5的290，316和454位分别进行定点突变，对290/316/454位进行组合突变。获得突变体I290V，I316L和L454C及组合突变体I290V/I316L/L454C的编码基因。
[0024]表1引物序列表
[0025][0026]I290V
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F、I290V
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R、LdTPS5
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F和LdTPS5
‑
R用于构建I290V突变体
[0027]I316L
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F、I316L
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R、LdTPS5
‑
F和LdTPS5
‑
R用于构建I316L突变体
[0028]L454C
‑
F、L454C
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R、LdTPS5
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F和LdTPS5
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R用于构建L454C突变体
[0029]I290V
‑
F、I290V
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R、I316L
‑
F、I316L
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R、L454C
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F、L454C
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R、LdTPS5
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F和LdTPS5
‑
R用于构建组合突变I290V/I316L/L454C突变体
[0030]实施例3：构建双环吉玛烯合酶突变体表达载体
[0031]选择表达载体pESC
‑
URA空载质粒，使用限制本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双环吉玛烯合成酶突变体，其特征在于，所述双环吉玛烯合成酶突变体包括以SEQ ID NO.1所示的野生型的双环吉玛烯合成酶核苷酸序列为模板，分别进行四个位点突变，获得四个突变体，所述四个突变体为：第290位异亮氨酸突变为缬氨酸形成的突变体I290V，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；第316位异亮氨酸突变为亮氨酸形成的突变体I316L，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；第454位亮氨酸突变为半胱氨酸形成的突变体L454C，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；第290位异亮氨酸突变为缬氨酸，第316位异亮氨酸突变为亮氨酸以及第454位亮氨酸突变为半胱氨酸形成的突变体I290V/I316L/L454C，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。2.一种双环吉玛烯合成酶突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因编码如权利要求1所述的任意一种双环吉玛烯合成酶突变体的氨基酸序列。3.一种包含双环吉玛烯...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔建军，闫晓光，聂升鑫，梁冬梅，李钰琨，葛建君，
申请(专利权)人：天津大学浙江绍兴研究院，
类型：发明
国别省市：