一种影响烟草质体色素合成相关的基因及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种影响烟草质体色素合成相关的基因及应用。该影响烟草质体色素合成相关的基因来源于烟草，命名为类果胶裂解酶(SPL)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，构建了用于敲除类果胶裂解酶基因的CRISPR/Cas9

【技术实现步骤摘要】
一种影响烟草质体色素合成相关的基因及应用


[0001]本专利技术涉及植物基因工程
，特别涉及一种影响烟草质体色素合成相关的基因及应用。

技术介绍

[0002]烟草烟叶中的质体色素不仅是烟株进行光合作用提供烟草生长所需营养的重要物质，也是影响烟叶外观质量和感官质量的重要物质。因此改变烟叶中质体色素含量的研究将有望用于改良烟草的品质。
[0003]新鲜烟叶中的质体色素主要可分为两大类，一类是叶绿素，包括叶绿素a和叶绿素b；另一种为类胡萝卜素，主要包括胡萝卜素和叶黄素。叶绿素降解产物新植二烯能增进烤烟的吃味和香气，降解转化形成致香成分；烟草中的类胡萝卜素主要有四种，即新黄质、紫黄质、叶黄素和β
‑
胡萝卜素，一方面类胡萝卜素含量直接决定烟叶的外观质量，另一方面类胡萝卜素类物质因双键断裂的部位不同可产生很多致香物质，如β
‑
大马酮、6
‑
甲基
‑5‑
庚烯
‑2‑
酮等对烟叶香味有十分重要的作用，是烟叶中挥发性香气成分的主要来源。
[0004]因此，改变质体色素含量的基因功能研究将为烟叶品质改善、烟草品种遗传改良提供遗传材料和理论依据。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种影响烟草质体色素合成相关的基因及应用，为烟叶品质改善、烟草品种遗传改良提供遗传材料和理论依据。
[0006]本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
[0007]一种影响烟草质体色素合成相关的基因，所述基因来源于烟草(Nicotiana tabacum)，命名为类果胶裂解酶(SPL)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]优选地，所述影响烟草质体色素合成相关的基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]一种提高烟叶质体色素含量的方法，所述方法为敲除烟草植株体内的的上述基因或使该基因的编码蛋白功能出现缺陷。
[0010]优选地，通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术进行敲除，具体包括以下步骤：
[0011](1)选择该基因中较特异的23nt核苷酸序列为CRISPR/Cas9的引导序列，并将该序列片段与CRISPR/Cas9载体进行连接、转化和PCR扩增检测，PCR阳性克隆，得CRISPR/Cas9
‑
spl编辑载体；
[0012](2)利用根癌农杆菌介导的遗传转化，将编辑载体CRISPR/Cas9
‑
spl转化烟草植株，筛选、鉴定获得转化阳性和编辑阳性植株，所述编辑阳性植株相较于对照的未转化植株，烟草叶片质体色素含量增加。
[0013]优选地，步骤(1)中，基因中较特异的23nt核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
[0014]一种影响烟草质体色素合成相关的基因在在提高烟叶质体色素含量中的应用。
[0015]优选地，基因敲除后，所述编辑阳性植株相较于对照的未转化植株，烟草成熟期叶片中的叶绿素和类胡萝卜素含量增加。
[0016]本专利技术上述技术方案，具有如下有益效果：
[0017]本专利技术提供的类果胶裂解酶基因，通过荧光定量PCR发现，该基因在叶片中有表达。在编辑烟草类果胶裂解酶基因的植株423中，烟草类果胶裂解酶基因在叶片中的表达量较对照(未转化)植株显著降低(如图1)。
[0018]本专利技术通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，构建了用于敲除类果胶裂解酶基因的CRISPR/Cas9
‑
spl编辑载体，经遗传转化后获得了类果胶裂解酶基因发生插入突变的红花大金元植株，所获编辑植株423叶片中的新黄质、叶黄素、叶绿素b、叶绿素a含量显著增加，表明该基因的敲除可影响植株叶片质体色素含量。
[0019]综上所述，利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术敲除类果胶裂解酶基因能够获得叶片中新黄质、叶黄素、叶绿素b、叶绿素a含量增加的基因编辑植株423，这为烟草质体色素合成通路研究，烟叶品质改善、烟草品种遗传改良提供遗传材料和理论依据。
附图说明
[0020]被结合在说明书中并构成说明书的一部分的附图示出了本专利技术的实施例，并且连同其说明一起用于解释本专利技术的原理。
[0021]图1为对照(未转化)植株叶片和基因编辑植株423叶片中类果胶裂解酶基因spl的相对表达量；
[0022]图2为对照(未转化)植株叶片和基因编辑植株423成熟期叶片中新黄质、叶黄素、叶绿素b、叶绿素a含量的对比图。
[0023]图3为对照(未转化)植株和基因编辑植株423在3个生长时期的根长、根重、茎长、地上重的对比图。
具体实施方式
[0024]现在将参照附图来详细描述本专利技术的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本专利技术的范围。
[0025]以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
[0026]本专利技术除非另有说明，否则百分号为体积百分数，比例为体积比。
[0027]实施例1
[0028]本实施例主要就烟草类果胶裂解酶基因spl的获得过程，简要介绍如下。
[0029]以栽培种烟草红花大金元叶片为样品，利用RNA提取试剂盒提取烟草叶片总RNA，反转录为cDNA备用。
[0030]通过同源比对的方法，参考拟南芥基因的序列及已知烟草部分基因序列，设计扩增引物序列如下：
[0031]F：5
’‑
ATGGCAATGAGTTTGTTGCT
‑3’
，(SEQ ID No.3)；
[0032]R：5
’‑
CTAGCACATGCGGCTTCTGC
‑3’
，(SEQ ID No.4)；
[0033]以上述所制备cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增：
[0034]扩增体系(50μL)：
[0035][0036][0037]混匀离心后进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃10sec，52℃30sec，72℃1.5min，共30个循环；72℃10min；12℃Hold。
[0038]对扩增产物进行提纯后测序，获得烟草类果胶裂解酶基因spl序列，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，共包括1359bp个碱基。对该基因序列进行翻译后，其所编码蛋白序列如SEQ ID No.2所示，共包括452个氨基酸，进一步对比分析表明，该蛋白含有同源性很高的序列，高度保守。
[0039]实施例2
[0040]利用实施例1中所获得类果胶裂解酶基因spl，本专利技术进一步构建了CRISPR/Cas9载体，相关构建过程简要介绍如下。
[0041]选择此基因中较特异的23nt核苷酸序列[GCATTAGGAA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种影响烟草质体色素合成相关的基因，其特征在于，所述基因来源于烟草，命名为类果胶裂解酶(SPL)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的影响烟草质体色素合成相关的基因，其特征在于，所述影响烟草质体色素合成相关的基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种提高烟叶质体色素含量的方法，其特征在于，所述方法为敲除烟草植株体内的如权利要求1所述的基因或使如权利要求2所述的编码蛋白功能出现缺陷。4.根据权利要求3所述的提高烟叶质体色素含量的方法，其特征在于，通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术进行基因敲除，具体包括以下步骤：(1)选择该基因中较特异的23nt核苷酸序列为CRISPR/Cas9的引导序列，并将该序列片段与CRISPR/Cas9载体进行连接、转化和PCR扩增检...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾婉俐，李雪梅，王明锋，孔维松，向海英，李晶，胡巍耀，蒋佳芮，许力，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：