芳樟醇合成酶突变体、重组表达载体、重组菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种通过蛋白质理性设计获得的芳樟醇合成酶t67OMcLIS

【技术实现步骤摘要】
芳樟醇合成酶突变体、重组表达载体、重组菌及其应用


[0001]本专利技术属于酶工程与代谢工程领域，具体涉及一种通过蛋白质理性设计获得活性提高的芳樟醇合成酶突变体编码它的核酸序列、含有该突变体基因的重组表达载体，以及在酿酒酵母中的表达及其应用。

技术介绍

[0002]芳樟醇是含有10个碳原子的链状单萜烯醇类化合物，主要存在于植物精油如芳樟油、薰衣草油、香柠檬油等中。由于其具有特殊的香气，是目前工业上用量最大的香精香料之一，占据了60
‑
80％的香料市场。此外芳樟醇还具有抗菌、驱避杀虫、消炎止痛以及镇静等多种生物学功效，具有重要的研究和应用价值。目前，芳樟醇主要来源于植物提取和化学合成。由于天然提取芳樟醇产量很低，分离提纯复杂，成本相对较高，并不能满足人们对天然香料日益增长的需求。化学法生产芳樟醇不可避免的会产生大量工业“三废”。随着合成生物学技术的高速发展，利用微生物细胞工厂进行各种生物产品的选择性合成已经成为可能。前期申请人通过在酿酒酵母中过表达甲羟戊酸途径中的限速酶以及引入异源的芳樟醇合酶，获得了一株产芳樟醇的酿酒酵母单倍体菌株(Biochemical Engineering Journal,2020,161:107655.)，并通过芳樟醇合成酶的定向进化以及表达调控，构建了一株产量达到了80.9mg/L的酿酒酵母菌株，是目前报道中酵母产芳樟醇的最高产量(Journal of Agricultural and Food Chemistry，2021,69,1003
‑
1010)，但该产量远未达到工业化水平。在此过程中，利用番茄红素的颜色变化建立了高通量筛选方法，对芳樟醇合成酶t67OMcLIS进行定向进化，最终筛选到了一株活性提高了52.7％的突变体t67OMcLISE343D/E352H(专利CN202010416910.3)。但是利用颜色变浅进行突变株高通量筛选时，由于颜色会达到饱和，假阳性效率高，很难进一步筛选到活性提高的突变体。

技术实现思路

[0003]专利技术目的：针对现有技术的不足，本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供一种通过蛋白质理性设计获得的芳樟醇合成酶t67OMcLIS
M
突变基因和其编码的蛋白。
[0004]本专利技术还要解决的技术问题是提供含有上述芳樟醇合成酶t67OMcLIS
M
突变基因和蛋白的重组载体和重组菌，及其构建方法和应用。
[0005]技术方案：为了解决上述技术变基因的核苷酸问题，本专利技术提供了一种芳樟醇合成酶t67OMcLISM突变体，所述突变体在野生型芳樟醇合成酶的第447位氨基酸发生突变。
[0006]进一步地，所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS
M
突变体包括以下几种之一：
[0007](1)所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS
M
突变体为t67OMcLIS
MF447E
，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；相对于芳樟醇合成酶野生型t67OMcLIS
M
(SEQ ID NO:13)的氨基酸其第447位的苯丙氨酸突变成了谷氨酸；
[0008](2)所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS
M
突变体为t67OMcLIS
MF447A
，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；相对于芳樟醇合成酶野生型t67OMcLIS
M
(SEQ ID NO:13)的氨基酸其第447位
的苯丙氨酸突变成了丙氨酸；
[0009](3)所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS
M
突变体为t67OMcLIS
MF447M
，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；相对于芳樟醇合成酶野生型t67OMcLIS
M
(SEQ ID NO:13)的氨基酸其第447位的苯丙氨酸突变成了甲硫氨酸；
[0010](4)所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS
M
突变体为t67OMcLIS
MF447Q
，其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；相对于芳樟醇合成酶野生型t67OMcLIS
M
(SEQ ID NO:13)的氨基酸其第447位的苯丙氨酸突变成了谷氨酰胺；
[0011](5)所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS
M
突变体为t67OMcLIS
MF447G
，其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；相对于芳樟醇合成酶野生型t67OMcLIS
M
(SEQ ID NO:13)的氨基酸其第447位的苯丙氨酸突变成了甘氨酸；
[0012](6)所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS
M
突变体为t67OMcLIS
M F447S
，其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；相对于芳樟醇合成酶野生型t67OMcLIS
M
(SEQ ID NO:13)的氨基酸其第447位的苯丙氨酸突变成了丝氨酸。
[0013]本专利技术还提供了上述突变体的突变型基因或核酸。
[0014]进一步地，上述突变型基因或核酸，即所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS
M
突变基因的核苷酸序列是下列核苷酸序列之一：
[0015](1)序列表中SEQ ID NO:1的核苷酸序列；
[0016](2)序列表中SEQ ID NO:2的核苷酸序列；
[0017](3)序列表中SEQ ID NO:3的核苷酸序列；
[0018](4)序列表中SEQ ID NO:4的核苷酸序列；
[0019](5)序列表中SEQ ID NO:5的核苷酸序列；
[0020](6)序列表中SEQ ID NO:6的核苷酸序列。
[0021]本专利技术还提供了表达盒、重组载体、重组菌株，其含有上述的突变型基因或核酸。
[0022]进一步地，所述重组载体为酿酒酵母载体，所述重组菌株为酿酒酵母菌。
[0023]本专利技术还提供了上述重组载体或重组菌株在高效合成芳樟醇中的应用。
[0024]本专利技术还提供了一种重组菌株的构建方法，包括以下步骤：
[0025](1)芳樟醇合成酶t67OMcLIS
M
突变基因的获得；
[0026](2)构建含有上述t67OMcLIS
M
突变基因的pUMRI
‑
16
‑
t67OMcLIS
M
‑
ERG20
F96W/N127W
重组质粒；
[0027](3)将重组质粒整合到酿酒酵母菌株中即得。
[0028]本专利技术还提供了一种重组菌的构建方法，包括以下步骤：
[0029](1)pUMRI
‑
16
‑
SKIK
‑
t67OMcLIS...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种芳樟醇合成酶t67OMcLIS
M
突变体，其特征在于，所述突变体在野生型芳樟醇合成酶的第447位氨基酸发生突变。2.根据权利要求1所述的芳樟醇合成酶t67OMcLIS
M
突变体，其特征在于，所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS
M
突变体包括以下几种之一：（1）所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS
M
突变体为t67OMcLIS
MF447E
，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；（2）所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS
M
突变体为t67OMcLIS
MF447A
，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；（3）所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS
M
突变体为t67OMcLIS
MF447M
，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；（4）所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS
M
突变体为t67OMcLIS
MF447Q
，其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；（5）所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS
M
突变体为t67OMcLIS
MF447G
，其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；（6）所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS
M
突变体为t67OMcLIS
M F447S
，其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。3.编码权利要求1或2所述的突变体的突变型基因或核酸。4.根据权利要求3所述的突变型基因或核酸，其特征在于，所述芳樟醇合成酶t67OMcLIS
M
突变基因的核苷酸序列是下列核苷酸序列之一：（1）序列表中SEQ ID NO:1的核苷酸序列；（2）序列表中SEQ ID NO:2的核苷酸序列；（3）序列表中SEQ ID NO:3的核苷酸序列；（4）序列表中SEQ ID NO:4的核苷酸序列；（5）序列表中SEQ ID NO:5的核苷酸序列；（6）序列表中SEQ ID NO:6的核苷酸序列。5.表达盒、重组载体、重组菌株，其含有权利要求3或4所述的突变型基因或核酸。6.权利要求5所述的重组载体或重组菌株在高效合成芳樟醇中的应用。7.权利要求5所述的重组菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）权利要求3或4所述的芳樟醇合成酶t67OMcLIS
M
突变基因的获得；（2）构建含有上述t67OMcLIS
M
突变基因的pUMRI
‑
16
‑
t67OMcLIS
M
‑
ERG20
F96W/N127W
重组质粒；（3）将重组质粒整合到酿酒酵母菌株中即得。8.权利要求5所述的重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）pUMRI
‑
16
...

【专利技术属性】
技术研发人员：周萍萍，方馨，周秀琪，杜家艳，袁豆豆，庞雪晴，原珂，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：