具有果胶酶活性的蛋白突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种具有果胶酶活性的蛋白突变体及其应用。该蛋白突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白相比，包含R150、R216和A238中的至少一个位点的突变。本发明专利技术提供的具有果胶酶活性的蛋白突变体在高温和较高pH条件下具有较高的反应活性稳定性，具有较大的工业应用潜力。具有较大的工业应用潜力。具有较大的工业应用潜力。

【技术实现步骤摘要】
具有果胶酶活性的蛋白突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种具有果胶酶活性的蛋白突变体及其应用。

技术介绍

[0002]果胶质是一种酸性多糖物质，广泛存在于植物界，主要存在于植物的细胞初生壁和细胞中间层，为内部细胞的支撑物质。果胶的化学结构复杂，果胶的主链是部分甲酯化的半乳聚糖，支链依据果胶质来源的不同而改变。去酯化的果胶被称作果胶酸或者多聚半乳糖醛酸。水解这类果胶物质的酶被广泛称作果胶酶。果胶酸裂解酶(EC.4.2.2.2)是通过β消除作用随机裂解果胶酸的α
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糖苷键将其降解。碱性耐热果胶酶可应用于一些传统的工业过程，如纺织和植物纤维处理、咖啡和茶业发酵、油料提取、含有果胶物质的工业废水处理等。由于微生物酶法在生物精炼及植物纤维脱胶等处理过程比传统的化学处理具有明显的优势，它能够减少化学处理过程中采用高浓度的强碱溶液对植物纤维的损害及后期污水的处理，因而也引起越来越多的研究。
[0003]酶学特性和酶的稳定性是影响其应用的关键因素之一。由于脱胶的过程多数是在碱性和较高温度条件下进行的，也就要求了参与这过程中的酶要必须要能耐受较高的温度和碱性环境。其中酶的热碱稳定性对于工业应用来说十分重要，而且高温和碱性条件下，酶的反应速度更快，能缩短反应周期，节约成本，也有利于避免反应过程中被其他微生物污染。
[0004]然而，目前虽然也有一些在碱性条件或高温条件下具有较好的催化活性的果胶酶，但其热、碱稳定性仍有较大的提升空间。
专利
技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的现有果胶酶在高温和碱性双极端条件下稳定性不足的问题，提供一种具有果胶酶活性的蛋白突变体及其应用，该具有果胶酶活性的蛋白在高温和较高pH条件下具有较高的反应活性稳定性，具有较大的工业应用潜力。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术一方面提供一种具有果胶酶活性的蛋白突变体，该蛋白突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白相比，包含R150、R216和A238中的至少一个位点的突变。
[0007]本专利技术第二方面提供如上第一方面所述的蛋白突变体的编码基因。
[0008]本专利技术第三方面提供一种重组载体，所述重组载体含有如上第二方面所述的编码基因。
[0009]本专利技术第四方面提供一种重组细胞，所述重组细胞含有如上第二方面所述的编码基因，或者，所述重组细胞含有如上第三方面所述的重组载体。
[0010]本专利技术第五方面提供一种用于降解果胶的组合物，所述组合物中含有如上第一方面所述的蛋白突变体。
[0011]本专利技术第六方面提供一种水解果胶的方法，所述方法包括将如上第一方面所述的蛋白突变体、第四方面所述的重组细胞，或第五方面所述的组合物与含果胶的底物接触，在水解条件下对果胶进行水解。
[0012]通过上述技术方案，本专利技术能够取得如下有益效果：
[0013](1)本专利技术提供的蛋白突变体的果胶酶活力高，并且具有较高的热碱稳定性，与其对应的野生型蛋白相比该蛋白突变体在60℃，pH10的热碱条件下保温4h的残余酶活提高4倍以上，更利于工业应用。
[0014](2)本专利技术提供的蛋白突变体源于天然果胶酶的突变体，使用时不易造成环境污染，且能够采用基因工程手段进行诱导表达生产，利于大规模工业应用推广。
附图说明
[0015]图1是测试例2中对不同突变体酶的热稳定性检测结果图。
具体实施方式
[0016]在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0017]本专利技术中，未作特殊说明的情况下，“野生型果胶酶”(“野生型蛋白”)即为嗜碱芽孢杆菌(Bacillus clausii)S10表达的果胶酶BacPelA，简称为WT。“果胶酶蛋白突变体1A”即为果胶酶BacPelA发生R150G单点突变的突变体，简称为1A。“果胶酶蛋白突变体2B”即为果胶酶BacPelA发生R216H单点突变的突变体，简称为2B。“果胶酶蛋白突变体3C”即为果胶酶BacPelA发生A238C单点突变的突变体，简称为3C。“果胶酶蛋白突变体4AB”即为果胶酶BacPelA发生R150G/R216H双点突变的突变体，简称为4AB。“果胶酶蛋白突变体5AC”即为果胶酶BacPelA发生R150G/A238C双点突变的突变体，简称为5AC。“果胶酶蛋白突变体6BC”即为果胶酶BacPelA发生R216H/A238C双点突变的突变体，简称为6BC。“果胶酶蛋白突变体FCM”即为果胶酶BacPelA发生R150G/R216H/A238C三点突变的突变体，简称为FCM。
[0018]本专利技术的专利技术人在研究中发现了一株嗜碱芽孢杆菌(Bacillus clausii)S10，该菌株能够表达在碱性条件下对不同甲基化果胶，尤其是对高甲基化果胶具有较高催化活性的果胶酶BacPelA(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)，且该果胶酶具有较好的耐热性，具有良好的工业应用潜力。然而，由于工业化应用过程中不仅要求酶具有耐热性和耐碱性，还需要其在高温碱性条件下具有较好的稳定性。基于此，专利技术人在进一步的研究中巧妙地发现，果胶酶BacPelA在特定位点(R150、R216和A238)发生特定突变后，获得的突变体不仅具有较好的耐热性和耐碱性，还具有了较高的热碱稳定性，更加适合工业脱胶应用。
[0019]ANVNFSMQGFATLNGGTTGGAGGDVVTVSTGDQLIAALKNKKANTPLTIYIDGTITPANTSASKIDIKDVNDVSLLGVGTNGELNGIGIKVWRANNVIIRNLKIHHVNTGDKDAISIEGPSKNIWVDHNELYNSLDVHKDYYDGLFDVKRDADYITFSWNYVHDSWKSMLMGSSDSDSYGRKITFHNNYFENLNSRVPSVRFGEAHIFSNYYADIRETGINSRMGAQVRIEENYFERANNPIVSRDSKEIGYWHLVNNRYVSSTGEQPTVSTTTYNPPYSYQATPVNQVKDVVRANAGVGVISP(SEQ ID NO:1)
[0020]基于上述发现，本专利技术一方面提供一种具有果胶酶活性的蛋白突变体，该蛋白突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白(即野生型果胶酶BacPelA)相比，包含R150、R216和A238中的至少一个位点的突变。
[0021]根据本专利技术的优选实施方式，其中，所述蛋白突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白相比，包含R150G、R216H和A238C中的至少一种突变。
[0022]优选地，所述蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有果胶酶活性的蛋白突变体，其特征在于，该蛋白突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白相比，包含R150、R216和A238中的至少一个位点的突变。2.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述蛋白突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白相比，包含R150G、R216H和A238C中的至少一种突变；优选地，所述蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示。3.权利要求1或2所述的蛋白突变体的编码基因。4.根据权利要求3所述的编码基因，其中，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：周成，薛燕芬，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：