高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株及其构建方法和应用，其中的构建方法为：敲除乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)YF11保藏编号为CGMCC No.12429基因组中的乳酸脱氢酶基因ldh，得到高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株YF11ΔLDH；本发明专利技术的重组菌株，通过代谢通路分流的策略实现了乳酸乳球菌乳亚种YF11碳代谢的再分配，减少流向乳酸的碳通量，从而减轻了发酵后期由于乳酸积累对菌株细胞活性造成的影响，发酵液中菌体量增加，进而提高了nisin的产量，可增加发酵液中菌体量，减缓发酵液pH下降趋势，显著提高nisin产量。显著提高nisin产量。显著提高nisin产量。

【技术实现步骤摘要】
高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及微生物领域，特别涉及高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]乳酸链球菌素(Nisin)是由乳酸乳球菌合成并释放到胞外的一种具有生物活性的多肽类物质。Nisin对大多数食源性革兰氏阳性细菌表现出广泛抑菌活性，包括单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌以及梭状芽胞杆菌等。此外，当nisin与其他抑菌剂(如抑菌物质、螯合剂、冷冻和热处理等)联合使用时还表现出协同效应。目前，nisin已在数十个国家获批作为天然防腐剂添加到食品中。随着细菌耐药性问题的出现，人们开始探索nisin作为抗生素替代品的可能性，并且已有关于nisin抑制某些抗生素耐药细菌生长的研究报道。
[0003]乳酸乳球菌是一种以乳酸为主要代谢产物的革兰氏阳性菌，常作为发酵剂用于食品工业中，尤其是乳制品发酵。乳酸乳球菌代谢途径相对简单、生长快速、无内毒素、具有生物安全性等特点，是研究最多的乳酸菌之一。乳酸乳球菌不仅在食品行业中应用广泛，其在生物制药及疫苗研究领域、作为细胞工厂用于生物基化学品的大规模生产方面都表现出巨大的潜力，但菌体量不高是限制乳酸乳球菌生产能力的一个重要因素。乳酸乳球菌是工业上最主要的nisin产生菌，乳酸是其主要代谢产物。在发酵过程中，乳酸乳球菌可将1分子葡萄糖代谢为2分子丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下反应生成乳酸。随着发酵进行，乳酸在发酵液中积累，导致菌株生长环境的酸化，影响菌株的生长和生产。另一方面，乳酸作为乳酸乳球菌的发酵副产物，大量积累还造成了碳源的浪费，增加了生产成本。现有关于改造乳酸乳球菌提高nisin产量策略有：增加nisin合成关键基因的拷贝数、表达相关基因提高菌株耐受能力、导入相关基因增加细胞能量供应等。工业上多采用补碱的方法将发酵液pH维持在适合菌株生产的水平，但乳酸盐积累仍会对菌株的生长产生影响。因此，建立新的菌株改造方法提高乳酸乳球菌的生物量及生产能力，不仅有利于进一步提高乳酸乳球菌的nisin产量，对于乳酸乳球菌生产应用也具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株。
[0005]本专利技术的第二个目的是提供一种高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株的构建方法。
[0006]本专利技术的第三个目的是提供上述高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株发酵生产乳酸链球菌素的应用。
[0007]本专利技术的第四个目的是提供第二种高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株。
[0008]本专利技术的第五个目的是提供第二种高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株的
构建方法。
[0009]本专利技术的第六个目的是提供第二种高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株发酵生产乳酸链球菌素的应用。
[0010]本专利技术的技术方案概述如下：
[0011]高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株的构建方法，包括如下步骤：
[0012]敲除乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)YF11保藏编号为CGMCCNo.12429基因组中的乳酸脱氢酶基因ldh，得到高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株YF11ΔLDH；所述乳酸脱氢酶基因ldh的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0013]上述方法构建的高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株。
[0014]上述高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株发酵生产乳酸链球菌素的应用。
[0015]第二种高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株的构建方法，包括如下步骤：
[0016](1)敲除乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)YF11保藏编号为CGMCC No.12429)基因组中的乳酸脱氢酶基因ldh，得到高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株YF11ΔLDH；所述乳酸脱氢酶基因ldh的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0017](2)敲除步骤(1)获得的高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株YF11ΔLDH基因组中的乳酸脱氢酶基因ldhB，得到高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株YF11ΔLDHΔLDHB；所述乳酸脱氢酶基因ldhB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0018]上述第二种高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株的构建方法构建的高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株。
[0019]上述高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株发酵生产乳酸链球菌素的应用。
[0020]本专利技术优点：
[0021]本专利技术的高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株，通过代谢通路分流的策略实现了乳酸乳球菌乳亚种YF11碳代谢的再分配，减少流向乳酸的碳通量，从而减轻了发酵后期由于乳酸积累对菌株细胞活性造成的影响，发酵液中菌体量增加，进而提高了nisin的产量，也为通过碳代谢分流的策略提高菌株nisin产量提供了思路。摇瓶实验结果表明，敲除乳酸乳球菌乳亚种YF11中的乳酸脱氢酶基因ldh，可增加发酵液中菌体量，减缓发酵液pH下降趋势，显著提高nisin产量。同时敲除乳酸乳球菌乳亚种YF11中的乳酸脱氢酶基因ldh和ldhB，可进一步增加发酵液中菌体量，减缓发酵液pH下降趋势，提高菌株nisin产量。
附图说明
[0022]图1为高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株发酵过程中的菌体量变化情况。
[0023]图2为高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株发酵过程中的发酵液pH变化情况。
[0024]图3为高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株nisin生产情况。
[0025]其中，YF11为原始菌株，YF11ΔLDH为YF11敲除乳酸脱氢酶基因ldh得到的重组菌株，YF11ΔLDHΔLDHB为YF11敲除乳酸脱氢酶基因ldh和ldhB得到的重组菌株。
具体实施方式
[0026]下面结合实施例对本专利技术做进一步的详细说明。
ID NO.12)进行菌落PCR验证，其中PCR产物在2444bp处有电泳条带的单菌落为阳性菌落，提取阳性菌落质粒并测序。结果正确的质粒即为含有乳酸乳球菌YF11乳酸脱氢酶基因ldh上游同源臂和下游同源臂基因片段的重组质粒，将其命名为pCS1966
‑
Δldh。其中用于菌落PCR的验证引物序列为：
[0044]General
‑
F：5
’‑
CTCACTCATTAGGCACCCC
‑3’
(SEQ ID NO.11)
[0045]General
‑
R：5
’‑
GAGATAACTGATGAACTATGGGAC
‑3’
(SEQ ID NO.12)；
[0046]2.构建高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株YF11ΔLDH)
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株的构建方法，其特征包括如下步骤：敲除乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)YF11保藏编号为CGMCC No.12429基因组中的乳酸脱氢酶基因ldh，得到高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株YF11ΔLDH；所述乳酸脱氢酶基因ldh的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1的方法构建的高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株。3.权利要求2的高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株发酵生产乳酸链球菌素的应用。4.高产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌重组菌株的构建方法，其特征包括如下步骤：(1)敲除乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lacti...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔建军，熊慧，吴昊，刘家亨，徐程杨，
申请(专利权)人：天津大学浙江绍兴研究院，
类型：发明
国别省市：