在植物细胞或整株植物中产生结合物-毒素融合蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及一种产生结合物

【技术实现步骤摘要】
在植物细胞或整株植物中产生结合物
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毒素融合蛋白的方法
[0001]本申请是2020年2月18日提交的题为“在植物细胞或整株植物中产生结合物
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毒素融合蛋白的方法”的中国专利申请202080029119.5的分案申请。
专利

[0002]本专利技术申请涉及结合物
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毒素融合蛋白的领域。

技术介绍

[0003]在四十年前已经开发了组合靶结合物和毒素的缀合物，现在代表着对抗癌症的主要希望。这些缀合物主要由抗体
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药物
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缀合物(ADC)类别代表，由通过接头与化学细胞毒性剂化学缀合的单克隆抗体组成。这些药物结合了单克隆抗体靶向癌细胞的特异性和有效载荷的高毒性效能，以杀死被靶向的细胞，同时使健康组织不受伤害。
[0004]然而，事实证明，这一观念难以转化为临床成功。尽管其对肿瘤细胞具有特异性，但在产品未达到其有效治疗剂量的情况下，经常会发生不良反应，导致相对狭窄的治疗窗口，这可能会限制其临床反应。通常在非靶向表达的组织中观察到剂量限制性毒性(脱靶效应)，主要是由于所用接头的相对不稳定性导致不需要的毒素释放，而不是由于抗体的特异性问题(Drake and Rabuka(2015))。
[0005]除了脱靶毒性之外，已经表明只有极少数(1
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2％)的完整缀合物到达被靶向肿瘤(Peters and Brown(2015))。由于这种不佳的靶向效率，细胞毒性有效载荷必须具有高效力，以在低剂量下仍能引起被靶向细胞死亡。
[0006]然而，由于上述的接头的相对不稳定性，使用高效力毒素要求接头在血流内必须是稳定的，以避免过早释放毒素，从而扩大治疗窗口(Parslow et al.(2016))。
[0007]化学缀合的毒性有效载荷具有与化学接头意外分离的风险，导致脱靶毒性(Alewine et al.(2014))。这种不稳定性限制了以这种方式生产的免疫缀合物的功效。
[0008]扩大抗体药物缀合物的治疗窗口的一种方法是开发与主要来自植物和细菌的高细胞毒性蛋白质或肽融合的抗体。这种方法最初是在二十世纪八十年代初期开发的。第一代这种缀合物由化学偶联于抗体的细胞毒性肽组成。
[0009]然而，已经讨论过的化学缀合的相对不稳定性，加上天然细胞毒性蛋白的高免疫原性，这些被认为是阻碍这些缀合物的治疗可用性的主要障碍。
[0010]然而，理论上，这些缀合物在治疗中具有巨大的潜力。大多数蛋白质毒素的作用机制是基于蛋白质合成抑制，这与常用的有机细胞毒素(主要是微管蛋白抑制剂或RNA聚合酶抑制剂)不同，这意味着非重叠的毒性特征，并促进与标准疗法的组合。
[0011]此外，细胞毒性蛋白似乎对化疗难治性患者中也有效，表明其不受针对有机细胞毒素观察到的肿瘤耐药机制的影响。
[0012]再者，与大多数有机细胞毒素不同，细胞毒性蛋白对于静止细胞(即不分裂的细胞)也有效。
[0013]此外，细胞毒性蛋白可以与抗体共表达，即以融合蛋白的形式。融合蛋白的这种重
组生产减少了对于化学接头技术观察到的不期望的有效载荷解离。
[0014]通过肽接头将蛋白质结合物例如抗体与细胞毒性蛋白质的遗传融合提供了一些优点。除了单纯的连接作用外，接头还可以影响融合蛋白的折叠、稳定性、药代动力学特征和生物活性，以及其在宿主细胞中的生产产量。
[0015]存在两类接头，即稳定接头和可切割接头。稳定接头由稳定的肽序列组成，其可具有延长的血浆半衰期并避免细胞毒性蛋白的意外释放。整个缀合物被内在化到细胞中，然后通过蛋白质结合物的细胞内降解而释放毒素。
[0016]许多哺乳动物蛋白酶敏感序列可用作设计可切割生物缀合物的接头。特别地，对癌细胞过表达的酶敏感的序列可用于将细胞毒性融合蛋白激活于靶细胞或肿瘤环境中。然而，这些使用哺乳动物酶敏感序列的复杂融合蛋白难以产生为标准系统(哺乳动物细胞(例如CHO或HEK)、昆虫细胞和酵母)，主要是因为即使在低背景表达的情况下也存在特定酶。在这种情况下，前肽通过其活性结构域的释放而被激活，诱导宿主细胞增殖的抑制。因此，必须在细菌表达系统中产生具有哺乳动物蛋白水解可切割接头的结合物
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毒素融合蛋白。然而，细菌无法正确折叠具有多个结构域的复杂蛋白质，并且缺乏形成二硫键的能力(Yin et al.(2007))。这些限制阻止了细菌系统产生单链抗体片段(scFv)和基于无糖基化细胞毒性蛋白的结合物
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毒素融合蛋白。然而，基于细菌scFv的小尺寸生物缀合物诱导快速肾脏清除，限制了这些分子的治疗窗口(Guo et al.(2016)。
[0017]WO2009064815公开了藻类叶绿体含有必要的机制以折叠复杂的结合物
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毒素融合蛋白，避免在标准系统中观察到的宿主细胞杀伤。事实上，莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)与原核生物中发现的叶绿体一样，只有一个叶绿体，但含有允许复杂蛋白质折叠的蛋白质(蛋白质二硫化物异构酶、分子伴侣)。WO2009064815证明了绿藻叶绿体适合产生可溶的功能性单链抗体(CD22)，其具有通过由两个重复G4S序列(四个甘氨酸，后接丝氨酸)组成的不可切割接头与蛋白质毒素融合的人IgG1的铰链、CH2、CH3结构域。然而，一个主要问题是微藻叶绿体的翻译后修饰，特别是缺乏用于N
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糖基化的酶机制，这是生物制药的一个关键特质(Mathieu
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Rivet et al.(2014))。
[0018]另一种基于人胚胎肾细胞(HEK
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293T)的方法使用不可切割的结合物
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毒素融合蛋白开发，所述融合蛋白由血管内皮生长因子121(VEG121)通过G4S稳定接头连接于受保护的颗粒酶B组成(Mohamedali et al.(2013))。蛋白酶颗粒酶B的功能结构域由一个额外的组氨酸标签保护，所述标签由肠激酶敏感位点连接，最大可能地避免宿主细胞杀伤。在产生后，必须通过额外的肠激酶处理步骤去除受保护的位点。尽管观察到了抗肿瘤功效，但这种结合物
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毒素融合蛋白的产生是复杂的。
[0019]所述限制可以通过使用经由肽接头与肽有效载荷连接的靶向部分的完全重组生物缀合来克服。例如，这种重组免疫缀合物例如使用与修饰的志贺样毒素缀合的CD20特异性单链可变片段(scFv)设计，并在原核表达系统中表达(WO2014164680A1)。由此产生的化合物在NHL的I/Ib期显示出有希望的结果，表明完整重组免疫缀合物可以减少化学缀合于肽毒素的抗体所观察到的脱靶毒性。
[0020]然而，基于scFv抗体的免疫缀合物已经示出具有非常有限的血液半衰期，这是由于肾脏清除限制了其功效所致，而通常用于产生基于scFv的免疫毒素的细菌模型不适合产生全长抗体或scFv
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Fc结构，因为其不能形成二硫键。此外本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产生结合物
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毒素融合蛋白的方法，所述融合蛋白至少包含：a)选自以下的一种蛋白质结合物
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抗体
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保留靶结合能力的抗体片段或衍生物，或
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抗体模拟物，b)任选地，肽接头，和c)至少一种蛋白质毒素或蛋白质原毒素所述方法包括以下步骤：(i)将植物细胞或整株植物与核酸构建体接触，所述核酸构建体至少包含可操作连接的以下：A)至少一种编码所述蛋白质结合物或其靶结合链或结构域的多核苷酸，以及B1)编码可切割肽接头的多核苷酸和编码蛋白质毒素的多核苷酸，或B2)编码蛋白质原毒素的多核苷酸，所述原毒素包含用于其激活的可切割结构域，(ii)使所述构建体整合到所述植物细胞或所述整株植物的一或多个细胞的核中，和(iii)表达由所述核酸构建体编码的所述融合蛋白。2.权利要求1的方法，其还包括以下步骤：(iv)回收和/或纯化步骤(iii)中表达的所述融合蛋白。3.前述权利要求任一项的方法，其中所述植物或植物细胞来自烟草属(Nicotiana)。4.前述权利要求任一项的方法，其中所述肽接头或原毒素中的可切割结构域可由哺乳动物细胞表达的酶或哺乳动物宿主产生的酶特异性或非特异性切割。5.前述权利要求任一项的方法，其中所述可切割接头或原毒素中的可切割结构域包含选自以下的至少一个切割位点：a)内体和/或溶酶体蛋白酶切割位点，b)胞质蛋白酶切割位点，和/或c)细胞表面蛋白酶切割位点。6.前述权利要求任一项的方法，其中所述肽接头或原毒素中的可切割结构域不能被植物细胞表达的酶或植物宿主产生的酶切割。7.前述权利要求任一项的方法，其中至少一种蛋白质毒素或原毒素是酶。8.前述权利要求任一项的方法，其中所述蛋白质毒素是选自以下的至少一种：(1)细胞死亡诱导蛋白，(2)蛋白质合成抑制剂，(3)膜扰动蛋白，(4)细胞分裂抑制蛋白。9.前述权利要求任一项的方法，其中至少一种蛋白质毒素是哺乳动物毒素或其保留所述蛋白质毒素毒性活性的片段，所述毒素优选选自颗粒酶类，更优选是颗粒酶B。10.用权利要求1至9任一项的方法产生的结合物
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毒素融合蛋白。11.结合物
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毒素融合蛋白，其至少包含：a)选择的一种蛋白质结合物，b)任选地，肽接头，和
c)至少一种蛋白质毒素或蛋白质原毒素，其中所述结合物
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毒素融合蛋白由核酸构建体编码，所述核酸构建体至少包含可操作连接的以下：A)至少一种编码所述蛋白质结合物或其靶结合链或结构域的多核苷酸，以及B1)编码可切割肽接头的多核苷酸和编码蛋白质毒素的多核苷酸，或B2)编码蛋白质原毒素的多核苷酸，所述原毒素包含用于其激活的可切割结构域。12.权利要求11的结合物
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毒素融合蛋白，所述蛋白包含至少一种植物特异性N
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聚糖。13.权利要求11至12任一项的结合物
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毒素融合蛋白，其中所述蛋白质结合物结合人CD20。14.权利要求11至13任一项的结合物
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【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：ATB治疗公司，
类型：发明
国别省市：