基于生存压力的筛选系统及高通量筛选装置制造方法及图纸

本公开涉及基于生存压力的筛选系统及高通量筛选装置。具体地，本公开涉及蛋白质融合蛋白的组合物、融合蛋白、重组核酸分子、重组表达载体、重组酵母菌株、基于生存压力的筛选系统、高通量筛选装置及用途，用于构建重组酵母菌株的方法，药物筛选的方法。本公开提供的融合蛋白I与融合蛋白II，是将报告蛋白拆分为两个结构域后分别与GPCR及G蛋白融合形成。融合蛋白I与融合蛋白II用于药物筛选可直接反馈GPCR激活后与G蛋白结合产生的生存报告信号，或反馈激活的GPCR由于激活效果被竞争性减弱或消除产生的报告信号，不需要经过酵母内转录调控和级联放大过程，信号更加真实可信，具有灵敏度高、受非正交信号干扰少、可靠性高等优势。势。势。

【技术实现步骤摘要】
indications.Nat.Rev.Drug Discov.16,829
–
842(2017).
[0009]3.Aristotelous,T.et al.Discovery ofβ2Adrenergic Receptor Ligands Using Biosensor Fragment Screening of Tagged Wild
‑
Type Receptor.ACS Med.Chem.Lett.4,1005
–
1010(2013).
[0010]4.Zhang,R.&Xie,X.Tools for GPCR drug discovery.Acta Pharmacol.Sin.33,372
–
384(2012).
[0011]5.Manglik,A.et al.Structure
‑
based discovery of opioid analgesics with reduced side effects.Nature537,185
–
190(2016).

技术实现思路

[0012]专利技术要解决的问题
[0013]鉴于现有技术中存在的问题，例如，目前GPCR药物筛选存在灵敏性、准确性不足的问题。
[0014]本公开的一个目的在于提供一种能够用于构建药物筛选的生存压力选择系统的融合蛋白。
[0015]本公开的另一目的在于提供一种将GPCR的激活或抑制直接反馈为生存报告信号的融合蛋白的组合物。
[0016]本公开的另一目的在于提供一种能够用于GPCR药物筛选的简单、稳定的重组酵母细胞或基于生存压力的筛选系统。
[0017]本公开的另一目的在于提供一种能够实现对GPCR药物高通量筛选的高通量筛选装置。
[0018]本公开的另一目的在于提供一种能够提高GPCR药物筛选的灵敏度、准确性的药物筛选方法。
[0019]用于解决问题的方案
[0020][1]一种融合蛋白的组合物，其中，所述组合物包括各自独立地存在的如下(i)所示的融合蛋白I与如下(iv)所示的融合蛋白II；或者，所述组合物包括各自独立地存在的如下(ii)所示的融合蛋白I与如下(iii)所示的融合蛋白II：
[0021](i)由第一蛋白与第一结构域融合形成的融合蛋白I；
[0022](ii)由第一蛋白与第二结构域融合形成的融合蛋白I；
[0023](iii)由第二蛋白与第一结构域融合形成的融合蛋白II；
[0024](iv)由第二蛋白与第二结构域融合形成的融合蛋白II；
[0025]其中，所述第一蛋白选自G蛋白偶联受体或其功能变体，所述第二蛋白选自G蛋白或其功能变体；所述第一结构域选自报告蛋白的羧基端结构域，所述第二结构域选自报告蛋白的氨基端结构域；
[0026]所述报告蛋白的羧基端结构域与所述报告蛋白的氨基端结构域用于形成报告蛋白，并且，所述报告蛋白释放用于检测的报告信号。
[0027][2]根据[1]所述的融合蛋白的组合物，其中，所述报告蛋白选自代谢途径中关键酶，或抗性蛋白；
[0028]可选地，所述报告蛋白选自由营养缺陷型筛选标记基因编码的代谢途径中关键
酶；优选地，所述营养缺陷型筛选标记基因为磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶的编码基因(trp1)。
[0029][3]根据[1]或[2]所述的融合蛋白的组合物，其中，所述报告蛋白为磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶(Trp1p)，所述第一结构域为磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶的羧基端结构域(Trp1p
CTD
)，所述第二结构域为磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶的氨基端结构域(Trp1p
NTD
)；
[0030]可选地，所述第一结构域选自如下(a1)
‑
(a2)中的任一项：
[0031](a1)如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽；
[0032](a2)如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列相比，具有至少80％的序列同一性，且具有或部分具有如SEQ ID NO:3所示的序列活性的多肽；
[0033]可选地，所述第二结构域选自如下(b1)
‑
(b2)中的任一项：
[0034](b1)如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；
[0035](b2)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，具有至少80％的序列同一性，且具有或部分具有如SEQ ID NO:1所示的序列活性的多肽。
[0036][4]根据[1]‑
[3]任一项所述的融合蛋白的组合物，其中，所述第一蛋白选自如下任意一种：β2‑
肾上腺素受体(β2AR)或其功能变体，人黑色素皮质受体
‑
4(MC4R)或其功能变体，黑色素皮质激素受体1(MC1R)或其功能变体；
[0037]优选地，所述第一蛋白为羧基端截短的β2
‑
肾上腺素受体(β2AR)、人黑色素皮质受体
‑
4(MC4R)或黑色素皮质激素受体1(MC1R)；
[0038]优选地，所述第一蛋白选自如下(c1)
‑
(c2)中的任一项：
[0039](c1)如SEQ ID NO:5
‑
8任一氨基酸序列所示的蛋白；
[0040](c2)与SEQ ID NO:5
‑
8任一氨基酸序列相比，具有至少80％的序列同一性，且具有或部分具有如SEQ ID NO:5
‑
8任一序列所示的序列活性的蛋白。
[0041][5]根据[1]‑
[4]任一项所述的融合蛋白的组合物，其中，所述第二蛋白选自miniG蛋白或其功能变体；优选地，所述第二蛋白选自如下(d1)
‑
(d2)中的任一项：
[0042](d1)如SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的蛋白；
[0043](d2)与SEQ ID NO:9所述的氨基酸序列相比，具有至少80％的序列同一性，且具有或部分具有如SEQ ID NO:9所示的序列活性的蛋白。
[0044][6]根据[1]‑
[5]任一项所述的融合蛋白的组合物，其中，所述融合蛋白I由所述第一结构域融合于所述第一蛋白的羧基端形成；
[0045]或者，所述融合蛋白I由所述第一结构域融合于所述第一蛋白的内部形成；
[0046]或者，所述融合蛋白I由所述第二结构域融合于所述第一蛋白的羧基端形成；
[0047]或者，所述融合蛋白I由所述第二结构域融合于所述第一蛋白的内部形成；
[0048]可选地，所述融合蛋白I包括连接所述第一结构域与所述第一蛋白的连接肽；或者，所述融合蛋白I包括连接所述第二结构域与所述第一蛋白的连接肽；
[0049]优选地，沿氨基端(N)向羧基端(C)方向，所述融合蛋白I具有如下(j1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白的组合物，其中，所述组合物包括各自独立地存在的如下(i)所示的融合蛋白I与如下(iv)所示的融合蛋白II；或者，所述组合物包括各自独立地存在的如下(ii)所示的融合蛋白I与如下(iii)所示的融合蛋白II：(i)由第一蛋白与第一结构域融合形成的融合蛋白I；(ii)由第一蛋白与第二结构域融合形成的融合蛋白I；(iii)由第二蛋白与第一结构域融合形成的融合蛋白II；(iv)由第二蛋白与第二结构域融合形成的融合蛋白II；其中，所述第一蛋白选自G蛋白偶联受体或其功能变体，所述第二蛋白选自G蛋白或其功能变体；所述第一结构域选自报告蛋白的羧基端结构域，所述第二结构域选自报告蛋白的氨基端结构域；所述报告蛋白的羧基端结构域与所述报告蛋白的氨基端结构域用于形成报告蛋白，并且，所述报告蛋白释放用于检测的报告信号。2.根据权利要求1所述的融合蛋白的组合物，其中，所述报告蛋白选自代谢途径中关键酶，或抗性蛋白；可选地，所述报告蛋白选自由营养缺陷型筛选标记基因编码的代谢途径中关键酶；优选地，所述营养缺陷型筛选标记基因为磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶的编码基因(trp1)。3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白的组合物，其中，所述报告蛋白为磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶(Trp1p)，所述第一结构域为磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶的羧基端结构域(Trp1p
CTD
)，所述第二结构域为磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶的氨基端结构域(Trp1p
NTD
)；可选地，所述第一结构域选自如下(a1)
‑
(a2)中的任一项：(a1)如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽；(a2)如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列相比，具有至少80％的序列同一性，且具有或部分具有如SEQ ID NO:3所示的序列活性的多肽；可选地，所述第二结构域选自如下(b1)
‑
(b2)中的任一项：(b1)如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；(b2)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，具有至少80％的序列同一性，且具有或部分具有如SEQ ID NO:1所示的序列活性的多肽。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的融合蛋白的组合物，其中，所述第一蛋白选自如下任意一种：β2
‑
肾上腺素受体(β2AR)或其功能变体，人黑色素皮质受体
‑
4(MC4R)或其功能变体，黑色素皮质激素受体1(MC1R)或其功能变体；优选地，所述第一蛋白为羧基端截短的β2
‑
肾上腺素受体(β2AR)、人黑色素皮质受体
‑
4(MC4R)或黑色素皮质激素受体1(MC1R)；优选地，所述第一蛋白选自如下(c1)
‑
(c2)中的任一项：(c1)如SEQ ID NO:5
‑
8任一氨基酸序列所示的蛋白；(c2)与SEQ ID NO:5
‑
8任一氨基酸序列相比，具有至少80％的序列同一性，且具有或部分具有如SEQ ID NO:5
‑
8任一序列所示的序列活性的蛋白。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的融合蛋白的组合物，其中，所述第二蛋白选自miniG蛋白或其功能变体；优选地，所述第二蛋白选自如下(d1)
‑
(d2)中的任一项：
(d1)如SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的蛋白；(d2)与SEQ ID NO:9所述的氨基酸序列相比，具有至少80％的序列同一性，且具有或部分具有如SEQ ID NO:9所示的序列活性的蛋白。6.根据权利要求1
‑
5任一项所述的融合蛋白的组合物，其中，所述融合蛋白I由所述第一结构域融合于所述第一蛋白的羧基端形成；或者，所述融合蛋白I由所述第一结构域融合于所述第一蛋白的内部形成；或者，所述融合蛋白I由所述第二结构域融合于所述第一蛋白的羧基端形成；或者，所述融合蛋白I由所述第二结构域融合于所述第一蛋白的内部形成；可选地，所述融合蛋白I包括连接所述第一结构域与所述第一蛋白的连接肽；或者，所述融合蛋白I包括连接所述第二结构域与所述第一蛋白的连接肽；优选地，沿氨基端(N)向羧基端(C)方向，所述融合蛋白I具有如下(j1)
‑
(j
16
)中的任一项所示的结构：(j1)(N)
‑
β2AR
‑
Trp1p
CTD
‑
(C)，(j2)(N)
‑
羧基端截短的β2AR
‑
Trp1p
CTD
‑
(C)，(j3)(N)
‑
β2AR
‑
连接肽
‑
Trp1p
CTD
‑
(C)，(j4)(N)
‑
羧基端截短的β2AR
‑
连接肽
‑
Trp1p
CTD
‑
(C)，(j5)(N)
‑
β2AR蛋白片段I
‑
Trp1p
CTD
‑
β2AR蛋白片段II
‑
(C)，(j6)(N)
‑
羧基端截短的β2AR蛋白片段I
‑
Trp1p
CTD
‑
羧基端截短的β2AR蛋白片段II
‑
(C)，(j7)(N)
‑
β2AR蛋白片段I
‑
连接肽
‑
Trp1p
CTD
‑
连接肽
‑
β2AR蛋白片段II
‑
(C)，(j8)(N)
‑
羧基端截短的β2AR蛋白片段I
‑
连接肽
‑
Trp1p
CTD
‑
连接肽
‑
羧基端截短的β2AR蛋白片段II
‑
(C)，(j9)(N)
‑
MC4R
‑
Trp1p
CTD
‑
(C)，(j
10
)(N)
‑
MC4R
‑
连接肽
‑
Trp1p
CTD
‑
(C)，(j
11
)(N)
‑
MC4R蛋白片段I
‑
Trp1p
CTD
‑
MC4R蛋白片段II
‑
(C)，(j
12
)(N)
‑
MC4R蛋白片段I
‑
连接肽
‑
Trp1p
CTD
‑
连接肽
‑
MC4R蛋白片段II
‑
(C)，(j
13
)(N)
‑
MC1R
‑
Trp1p
CTD
‑
(C)，(j
14
)(N)
‑
MC1R
‑
连接肽
‑
Trp1p
CTD
‑
(C)，(j
15
)(N)
‑
MC1R蛋白片段I
‑
Trp1p
CTD
‑
MC1R蛋白片段II
‑
(C)，(j
16
)(N)
‑
MC1R蛋白片段I
‑
连接肽
‑
Trp1p
CTD
‑
连接肽
‑
MC1R蛋白片段II
‑
(C)；优选地，所述融合蛋白I选自如下(e1)
‑
(e2)中的任一项：(e1)如SEQ ID NO:10
‑
13任一项所示氨基酸序列的蛋白；(e2)与SEQ ID NO:10
‑
13任一项所述的氨基酸序列相比，具有至少80％的序列同一性，且具有或部分具有如SEQ ID NO:10
...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘翔宇，何国栋，
申请(专利权)人：北京宏岭隆成科技有限公司，
类型：发明
国别省市：