一种融合蛋白的组合物、包含其的基于生存压力的负向筛选系统技术方案

本公开涉及融合蛋白的组合物、包含其的基于生存压力的负向筛选系统，具体涉及融合蛋白的组合物、融合蛋白、重组核酸分子、重组表达载体、重组酵母菌株、基于生存压力的负向筛选系统、高通量筛选装置及用途，用于构建重组酵母菌株的方法，药物筛选的方法。本公开的融合蛋白I与融合蛋白II，将报告蛋白拆分为两个结构域后分别与GPCR及G蛋白融合形成，报告蛋白为具有细胞毒性的蛋白。融合蛋白的组合物用于药物筛选可反馈激活的GPCR或激活的GPCR由于激活效果被竞争性减弱或消除产生的报告信号，以筛选GPCR药物，不需要经过酵母内转录调控和级联放大过程，信号更加真实可信，具有灵敏度高、受非正交信号干扰少、可靠性高等优势。可靠性高等优势。可靠性高等优势。

【技术实现步骤摘要】
一种融合蛋白的组合物、包含其的基于生存压力的负向筛选系统


[0001]本公开属于生物医药
，涉及融合蛋白的组合物、包含其的基于生存压力的负向筛选系统。具体来说，本公开涉及一种融合蛋白的组合物、融合蛋白、重组核酸分子、重组表达载体、重组酵母菌株、基于生存压力的负向筛选系统、高通量筛选装置及用途，以及用于构建重组酵母菌株的方法，药物筛选的方法。

技术介绍

[0002]G蛋白偶联受体(G Protein Coupled Receptor)，简称GPCR，是真核生物目前已知的最大的膜蛋白受体超家族，据报道，在人体基因组中有超过800个不同亚型的GPCR2。它们广泛分布于人体多种组织器官，感知包括激素、神经递质、多肽和蛋白等多种胞外信号分子的刺激，并介导细胞内下游信号转导通路，与人体多种代谢活动密切相关。因此，GPCR也被认为是最重要的药物靶点之一，目前FDA已经批准上市的药物中已有超过1/3的靶向各类GPCR3，例如β
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阻滞剂(β
‑
blocker)作为β肾上腺素受体的拮抗剂，广泛用于心血管疾病的治疗。筛选针对特定GPCR的激动剂或拮抗剂药物具有很强的研究价值和应用前景。目前已有的GPCR药物筛选方法主要包括针对受体
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配体相互作用的筛选方法(如利用表面等离子共振技术的筛选方法)4、基于受体功能的间接筛选方法(如通过检测G蛋白下游CAMP或钙离子等的筛选方法)5以及以虚拟筛选6为代表的基于结构的筛选方法。传统的GPCR药物筛选方法往往存在不同的局限性，比如基于亲和力的表面等离子共振筛选方法要求对靶点GPCR进行表达和纯化，而许多GPCR由于自身性质不稳定，很难在体外获得性质稳定且有功能的蛋白样品，并且通过此方法筛选得到的小分子的功能是未知的，需要进一步鉴定。基于受体细胞信号转导功能的筛选方法也存在以下局限性，首先哺乳动物细胞培养成本较高并且对于常用有机溶剂二甲基亚砜(DMSO)非常敏感，高浓度的溶剂会对细胞状态产生较大影响从而使得结果信噪比较差；其次，由于哺乳动物细胞具有复杂的各级信号转导通路，这些信号通路往往与GPCR下游信号通路相互关联，因此也会有较多假阳性的出现；最后，基于受体信号转导功能的筛选方法往往以荧光(Fluorescence)或者生物发光(Luminescence)作为信号，存在信号窗口时间短、信号不稳定、检测设备要求高等问题。这些问题限制了传统方法对于GPCR配体的筛选和鉴定。
[0003]为了解决传统方法检测荧光信号或生物发光信号存在的局限性，在申请人前期工作中，开发了基于酵母生长速率汇报目的GPCR激活的基于生存压力的筛选(Survival Pressure Selection，SPS)方法(专利名称为“基于生存压力的筛选系统及高通量筛选装置”，CN115925970A)。该方法实现了通过激活目的GPCR促进酵母生长，更适合用于筛选目的GPCR的激动剂药物。
[0004]然而，仍有待开发新的GPCR药物筛选系统及方法，尤其是针对GPCR拮抗剂的药物筛选系统及方法，以提高GPCR药物筛选的灵敏度，减少药物筛选的假阳性结果。

技术实现思路

[0005]专利技术要解决的问题
[0006]针对以上这些已有方法的局限性，本公开开发出了一套以酿酒酵母为宿主细胞的基于功能的筛选系统，用于直接筛选靶点GPCR的拮抗剂药物。
[0007]用于解决问题的方案
[0008]为了开发更适合筛选目的GPCR拮抗剂药物的方法，本公开需要实现通过抑制目的GPCR促进酵母生长。因此，本公开构建了基于生存压力的负向筛选体系(negative survival pressure selection system,nSPS system)，将GPCR蛋白的激活信号呈现为一类具有细胞毒性的蛋白的功能性重组，通过检测酵母生长速度差异表征能够通过抑制GPCR激活从而阻止该毒性蛋白功能性重组的化合物，从而寻找靶点GPCR的拮抗剂。
[0009]本公开通过以下技术方案实现上述目的：
[0010][1].一种融合蛋白的组合物，其中，所述组合物包括各自独立地存在的如下(i)所示的融合蛋白I与如下(iv)所示的融合蛋白II；或者，所述组合物包括各自独立地存在的如下(ii)所示的融合蛋白I与如下(iii)所示的融合蛋白II：
[0011](i)由第一蛋白与第一结构域融合形成的融合蛋白I；
[0012](ii)由第一蛋白与第二结构域融合形成的融合蛋白I；
[0013](iii)由第二蛋白与第一结构域融合形成的融合蛋白II；
[0014](iv)由第二蛋白与第二结构域融合形成的融合蛋白II；
[0015]其中，所述第一蛋白选自G蛋白偶联受体或其功能变体，所述第二蛋白选自G蛋白或其功能变体；所述第一结构域选自报告蛋白的羧基端结构域，所述第二结构域选自报告蛋白的氨基端结构域；
[0016]所述报告蛋白的羧基端结构域与所述报告蛋白的氨基端结构域用于形成报告蛋白，并且，所述报告蛋白为具有细胞毒性的蛋白，释放用于检测的报告信号。
[0017][2].根据[1]所述的融合蛋白的组合物，其中，所述报告蛋白来自白喉毒素。
[0018][3].根据[1]或[2]所述的融合蛋白的组合物，其中，所述报告蛋白为白喉毒素A亚基(DTA)，所述第一结构域为白喉毒素A亚基的羧基端结构域(DTA
CTD
)，所述第二结构域为白喉毒素A亚基的氨基端结构域(DTA
NTD
)；
[0019]可选地，所述第一结构域选自如下(a1)
‑
(a2)中的任一项：
[0020](a1)如SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的多肽；
[0021](a2)如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列相比，具有至少80％的序列同一性，且具有或部分具有如SEQ ID NO:9所示的序列活性的多肽；
[0022]可选地，所述第二结构域选自如下(b1)
‑
(b2)中的任一项：
[0023](b1)如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的多肽；
[0024](b2)与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列相比，具有至少80％的序列同一性，且具有或部分具有如SEQ ID NO:11所示的序列活性的多肽。
[0025][4].根据[1]‑
[3]任一项所述的融合蛋白的组合物，其中，所述第一蛋白选自如下任意一种：β2
‑
肾上腺素受体(β2AR)或其功能变体，人神经介素B受体(NMBR)或其功能变体；
[0026]优选地，所述第一蛋白为β2
‑
肾上腺素受体(β2AR)或人神经介素B受体(NMBR)；
[0027]更优选地，所述第一蛋白选自如下(c1)
‑
(c2)中的任一项：
[0028](c1)如SEQ ID NO:1或3任一氨基酸序列所示的蛋白；
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白的组合物，其中，所述组合物包括各自独立地存在的如下(i)所示的融合蛋白I与如下(iv)所示的融合蛋白II；或者，所述组合物包括各自独立地存在的如下(ii)所示的融合蛋白I与如下(iii)所示的融合蛋白II：(i)由第一蛋白与第一结构域融合形成的融合蛋白I；(ii)由第一蛋白与第二结构域融合形成的融合蛋白I；(iii)由第二蛋白与第一结构域融合形成的融合蛋白II；(iv)由第二蛋白与第二结构域融合形成的融合蛋白II；其中，所述第一蛋白选自G蛋白偶联受体或其功能变体，所述第二蛋白选自G蛋白或其功能变体；所述第一结构域选自报告蛋白的羧基端结构域，所述第二结构域选自报告蛋白的氨基端结构域；所述报告蛋白的羧基端结构域与所述报告蛋白的氨基端结构域用于形成报告蛋白，并且，所述报告蛋白为具有细胞毒性的蛋白，释放用于检测的报告信号。2.根据权利要求1所述的融合蛋白的组合物，其中，所述报告蛋白来自白喉毒素。3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白的组合物，其中，所述报告蛋白为白喉毒素A亚基(DTA)，所述第一结构域为白喉毒素A亚基的羧基端结构域(DTA
CTD
)，所述第二结构域为白喉毒素A亚基的氨基端结构域(DTA
NTD
)；可选地，所述第一结构域选自如下(a1)
‑
(a2)中的任一项：(a1)如SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的多肽；(a2)如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列相比，具有至少80％的序列同一性，且具有或部分具有如SEQ ID NO:9所示的序列活性的多肽；可选地，所述第二结构域选自如下(b1)
‑
(b2)中的任一项：(b1)如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的多肽；(b2)与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列相比，具有至少80％的序列同一性，且具有或部分具有如SEQ ID NO:11所示的序列活性的多肽。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的融合蛋白的组合物，其中，所述第一蛋白选自如下任意一种：β2
‑
肾上腺素受体(β2AR)或其功能变体，人神经介素B受体(NMBR)或其功能变体；优选地，所述第一蛋白为β2
‑
肾上腺素受体(β2AR)或人神经介素B受体(NMBR)；更优选地，所述第一蛋白选自如下(c1)
‑
(c2)中的任一项：(c1)如SEQ ID NO:1或3任一氨基酸序列所示的蛋白；(c2)与SEQ ID NO:1或3任一氨基酸序列相比，具有至少80％的序列同一性，且具有或部分具有如SEQ ID NO:1或3任一序列所示的序列活性的蛋白。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的融合蛋白的组合物，其中，所述第二蛋白选自miniG蛋白或其功能变体；优选地，所述第二蛋白选自如下(d1)
‑
(d2)中的任一项：(d1)如SEQ ID NO:5或6任一所示氨基酸序列的蛋白；(d2)与SEQ ID NO:5或6任一所述的氨基酸序列相比，具有至少80％的序列同一性，且具有或部分具有如SEQ ID NO:5或6所示的序列活性的蛋白。6.根据权利要求1
‑
5任一项所述的融合蛋白的组合物，其中，所述融合蛋白I由所述第一结构域融合于所述第一蛋白的羧基端形成；或者，所述融合蛋白I由所述第二结构域融合
于所述第一蛋白的羧基端形成；可选地，所述融合蛋白I包括连接所述第一结构域与所述第一蛋白的连接肽；或者，所述融合蛋白I包括连接所述第二结构域与所述第一蛋白的连接肽；优选地，沿氨基端(N)向羧基端(C)方向，所述融合蛋白I具有如下(j1)
‑
(j4)中的任一项所示的结构：(j1)(N)
‑
β2AR
‑
DTA
CTD
‑
(C)，(j2)(N)
‑
β2AR
‑
连接肽
‑
DTA
CTD
‑
(C)，(j3)(N)
‑
NMBR
‑
DTA
CTD
‑
(C)，(j4)(N)
‑
NMBR
‑
连接肽
‑
DTA
CTD
‑
(C)；优选地，所述融合蛋白I选自如下(e1)
‑
(e2)中的任一项：(e1)如SEQ ID NO:13或15任一项所示氨基酸序列的蛋白；(e2)与SEQ ID NO:13或15任一项所述的氨基酸序列相比，具有至少80％的序列同一性，且具有或部分具有如SEQ ID NO:13或15任一项所示的序列活性的蛋白。7.根据权利要求1
‑
6任一项所述的融合蛋白的组合物，其中，其中，所述融合蛋白II由所述第一结构域融合于所述第二蛋白的内部或氨基端形成；或者，所述融合蛋白II由所述第二结构域融合于所述第二蛋白的内部或氨基端成形成；可选地，所述融合蛋白II包括连接所述第一结构域与所述第二蛋白的第二连接肽；或者，所述融合蛋白II包括连接所述第二结构域与所述第二蛋白的第二连接肽；优选地，沿氨基端(N)向羧基端(C)方向，所述融合蛋白II具有如下(k1)
‑
(k4)中的任一项所示的结构：(k1)(N)
‑
miniG蛋白片段I
‑
DTA
NTD
‑
miniG蛋白片段II
‑
(C)，(k2)(N)
‑
miniG蛋白片段I
‑
连接肽
‑
DTA
NTD
‑
连接肽
‑
miniG蛋白片段II
‑
(C)，(k3)(N)
‑
DTA
NTD
‑
miniG蛋白
‑
(C)，(k4)(N)
‑
DTA
NTD
‑
连接肽
‑
miniG蛋白
‑
(C)，其中，miniG蛋白由所述miniG蛋白片段I与所述miniG蛋白片段II融合形成；优选地，所述融合蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘翔宇，徐涛，何国栋，
申请(专利权)人：北京宏岭隆成科技有限公司，
类型：发明
国别省市：