一种生物探针及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，具体公开了一种生物探针及其应用，以依赖TOM

【技术实现步骤摘要】
一种生物探针及其应用


[0001]本申请涉及生物检测
，具体公开了一种生物探针及其应用。

技术介绍

[0002]线粒体是真核细胞生存必需的细胞器，不仅作为能量工厂合成绝大部分生命活动所需ATP，而且在细胞代谢和信号传导等生物学过程中扮演了重要角色，线粒体具有双层膜结构(外膜、内膜)和两个亲水性区室(膜间间隙、基质)。依据物种的不同，线粒体包含1000
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1500种不同的蛋白质，其中99％的线粒体蛋白都是由细胞核基因编码在细胞质中以前体蛋白形式合成，并通过外膜TOM复合体导入线粒体，再根据自身携带的定位信号被相应的蛋白质转运机器识别、分选至特定的线粒体亚区室，进而行使其生物学功能。
[0003]线粒体蛋白导入与分选决定着线粒体蛋白的定位和功能，是衡量线粒体健康状态的关键指标，对维持线粒体的正常功能以及细胞的生命活动有着至关重要的作用。目前已知的线粒体蛋白导入与分选系统是由六大复合体为核心的线粒体导入蛋白机器构成，即TOM、SAM、MIM、TIM23、TIM22和MIA。其中任何一种导入和分选机器发生故障，都有可能导致大量线粒体蛋白无法正确、高效地定位，从而引起线粒体功能失调，进而导致疾病的发生。与线粒体导入与分选系统调控因子有关的疾病，常常导致一些高能量需求的组织器官发生病变，例如大脑、心脏、肌肉和肾脏。
[0004]线粒体导入与分选系统的六大复合体核心成分都是在酵母中发现的，然而有近一半的酵母线粒体导入与分选调控因子仍没有找到对应的人类同源蛋白，例如，2004年研究人员在酵母中发现一种MIM复合体，由Mim1和Mim2两种亚基构成，能够帮助α螺旋蛋白插入到线粒体外膜，并且这一过程不依赖于TOM复合体，然而根据蛋白质序列保守性分析，人类蛋白质组中并不存在Mim1/2的同源蛋白，因此研究者们始终没有发现酵母MIM复合体在人类线粒体中的同源对应物，但在人类线粒体中发现了与其具有相同功能的非同源蛋白MTCH2，而关于MTCH2插入酶的功能研究尚不完善，其是否形成类似MIM的复合体以及复合体的成分包含哪些蛋白等问题都有待探究。根据现有的技术资料显示，绝大部分线粒体蛋白都需要通过TOM复合体进入线粒体，也有近百种线粒体蛋白的导入不依赖Tom40，其中，基质、膜间隙、内膜蛋白占了一半。由此可见，仍有许多线粒体蛋白的导入机制尚不完全清楚，探索人类线粒体导入与分选系统中尚未发现的关键调控因子，对于理解线粒体生物生成和功能调控有重要意义。
[0005]传统的方法鉴定隐藏的线粒体导入与分选调控因子需要纯化线粒体并且需要体外翻译合成放射性元素标记的底物蛋白，不仅耗时耗力，而且难以进行高通量筛选；也有研究者们利用分裂荧光素酶系统开发出实时监测线粒体蛋白质导入效率的新方法，利用该方法研究分析了多个酵母线粒体蛋白质导入系统的动力学特征，但是该研究工作仍然基于线粒体纯化方法，体外分离的线粒体在导入了外源正电荷底物后，膜电势显著下降并且无法恢复，从而导致研究过程存在局限性。
[0006]因此，专利技术人有鉴于此，提供了一种生物探针，以便解决上述问题。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种生物探针，用以寻找哺乳动物细胞中隐藏的线粒体导入系统调控因子，以便更全面地了解线粒体蛋白质导入与分选系统。
[0008]为了达到上述目的，本专利技术的基础方案提供一种生物探针，所述生物探针包括线粒体基质定位序列MTSmatrix与核定位序列NLS，所述生物探针的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0009]进一步，所述生物探针还包括引导序列，所述引导序列为不依赖于Tom40途径进入线粒体的线粒体底物蛋白的全长序列或者转运肽序列。
[0010]进一步，所述引导序列来源于线粒体基质、内膜或膜间间隙蛋白。
[0011]进一步，所述生物探针还包括GFP C端的1个β链。
[0012]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0013]本专利技术以依赖TOM
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TIM23途径的基质引导序列MTSmatrix为核心，并搭配核定位序列NLS以提高辨识度，使得生物探针在正常情况下定位于线粒体，TOM
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TIM23导入途径功能受损时定位于细胞核，从而可以利用高内涵成像系统进行筛选，例如RNAi筛选或者药物筛选等，根据探测器的线粒体
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核定位改变判断筛选基因是否为导入调控因子；采用不依赖于Tom40途径进入线粒体的底物蛋白全长序列或者转运肽序列作为生物探针的引导序列，用于筛选不依赖于Tom40的线粒体导入途径调控因子。
[0014]基于同一专利技术构思，本专利技术还提供一种表达载体，所述表达载体上装载有如上所述的生物探针。
[0015]基于同一专利技术构思，本专利技术还提供一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包含如上述的生物探针，或所述重组细胞包含如上述的表达载体。
[0016]本专利技术的表达载体、重组质粒能够应用于高通量筛选，以寻找参与线粒体蛋白导入与分选的关键调控因子，从而更全面地了解线粒体蛋白质导入与分选系统。
[0017]基于同一专利技术构思，本专利技术还提供上述的生物探针和/或上述的表达载体和/或上述的重组质粒在寻找参与线粒体蛋白导入与分选的关键调控因子中的应用。
[0018]基于同一专利技术构思，本专利技术还提供上述的生物探针和/或上述的表达载体和/或上述的重组质粒在医疗诊断和/或治疗中的应用。
[0019]基于同一专利技术构思，本专利技术还提供一种线粒体蛋白导入与分选的关键调控因子的筛选方法，包括使用上述的生物探针和/或上述的表达载体和/或上述的重组质粒对线粒体蛋白导入与分选的关键调控因子进行筛选。
附图说明
[0020]为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0021]图1示出了本申请实施例提出的一种生物探针的工作原理示意图；
[0022]图2示出了本申请实施例中探测器1号响应膜电势的变化实验结果图；
[0023]图3示出了本申请实施例中核定位序列对CCCP不响应的实验结果图；
[0024]图4示出了本申请实施例中探测器1号对药物的响应实验结果图；
[0025]图5示出了本申请实施例中药物诱导mtROS产生的实验结果图；
[0026]图6示出了本申请实施例中探测器1号对ddC的响应实验结果图；
[0027]图7示出了本申请实施例中敲低部分关键调控因子对探测器1号的影响实验结果图；
[0028]图8示出了本申请实施例中敲低另外部分关键调控因子对探测器1号的影响实验结果图；
[0029]图9示出了本申请实施例中探测器性能测试统计结果示意图；
[0030]图10示出了本申请实施例中升级后的1
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4号探测器工作原理图。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物探针，其特征在于：所述生物探针包括线粒体基质定位序列MTSmatrix与核定位序列NLS，所述生物探针的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.根据权利要求1所述的一种生物探针，其特征在于，所述生物探针还包括引导序列，所述引导序列为不依赖于Tom40途径进入线粒体的线粒体底物蛋白的全长序列或者转运肽序列。3.根据权利要求2所述的一种生物探针，其特征在于，所述引导序列来源于线粒体基质、内膜或膜间间隙蛋白。4.根据权利要求1至3任一所述的一种生物探针，其特征在于，所述生物探针还包括GFPC端的1个β链。5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体上装载有如权利要求1至4任一所述的生物探针。6.一种重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱健，曾维倩，唐富亮，
申请(专利权)人：中南大学湘雅医院，
类型：发明
国别省市：