一种改造型GPR35及其用途制造技术

本公开提供了一种改造型GPR35及其用途。具体地，本公开提供了一种改造型GPR35，其中，所述改造型GPR35包含以下序列中的一种或多种：(a1)如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列；(a2)与SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列具有至少80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列等。本公开提供的改造型GPR35对原本不适用于非激活态结构研究的蛋白质序列进行融合、改造，使得利用冷冻电镜技术对于GPR35的结构研究成为可能，可用于GPR35结构解析、GPR35活性分析、核酸编码小分子库筛选、计算机辅助的药物设计、筛选等。筛选等。筛选等。

【技术实现步骤摘要】
一种改造型GPR35及其用途


[0001]本公开属于生物
，具体地，本公开涉及一种改造型GPR35及其用途。

技术介绍

[0002]G蛋白偶联受体(G protein
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coupled receptor,GPCR)是人体最大的一类细胞膜受体1。人体有超过800个G蛋白偶联受体成员，其中约有370个非嗅觉类G蛋白偶联受体和超过400个嗅觉类受体。不同的G蛋白偶联受体参与介导生物体的一系列重要的生物功能，从化学感知识别到内分泌分子相关的调节等。统计表明，FDA批准上市的临床药物中，约占总数35％的药物靶向约135个不同的G蛋白偶联受体。正在进行的临床研究中，有20％以上的测试药物均靶向G蛋白偶联受体2。尽管如此，有50％左右的非嗅觉类G蛋白偶联受体可能是潜在的疾病治疗靶点，仍然没有相关的新药临床测试，这有待进一步的开拓和研究。由此可见，G蛋白偶联受体家族成员在新药研发领域的价值和潜力3。
[0003]通过一系列的技术革新，包括快速投入冷冻制样技术的成熟，直接电子检测器的发展和三维重构软件的改进，冷冻电镜单粒子技术被广泛应用于近原子分辨率下的蛋白质及生物大分子结构研究工作4。2017年，诺贝尔化学奖授予三位在冷冻电镜技术开发过程中作出卓越贡献的科学家，这标志着结构生物学领域进入一个新时代。冷冻电镜技术已经超越传统的X
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射线晶体学和核磁共振技术，成为结构生物学和新药研发领域最前沿和热门的结构研究手段5。
[0004]G蛋白偶联受体是具有经典的7次跨膜结构特征，是结构高度动态的蛋白质6。一些经典的研究G蛋白偶联受体结构的方法包括对受体进行热稳定性突变，在受体的N段或者胞内第三个无序区融合T4溶菌酶7、b562融合蛋白(BRIL)8等融合蛋白，开发靶向GPCR细胞内侧或细胞外侧的抗体或纳米抗体，形成GPCR
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G蛋白或arrestin蛋白复合物等。在细胞内第三个跨膜螺旋引入融合蛋白能够有效的提高GPCR的结构稳定性，并增加受体的分子量，在传统的晶体学时代，融合蛋白能够增加受体
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受体之间形成晶体堆积的可能性。随着冷冻电镜技术的发展，利用融合蛋白进行结构解析的价值被弱化，其中一个原因就是GPCR和G蛋白或下游信号蛋白复合物更有利于解释受体的生物学功能。然而，新药研发企业面临的挑战是，针对部分重要的GPCR而言，临床上的靶向受体非激活态的拮抗剂更具有临床治疗价值。如何利用冷冻电镜的优势，快速高效地获得受体非激活态的结构，并利用基于结构的药物筛选/优化方案，进行新药开发是这个领域面临的挑战。
[0005]上述用于与G蛋白偶联受体融合的BRIL是在脱辅基细胞色素(apocytochrome)b562的氨基酸序列中导入了M7W、H102I和R106L的氨基酸残基取代的热耐性apocytochrome b562突变蛋白(也称为cytochrome b562RI)(Protein Data Bank ID：PDB 1M6T)。BRIL融合蛋白作为G蛋白偶联受体家族最经典的融合蛋白之一，迄今为止已广泛应用于超过20个G蛋白偶联受体的结构解析研究9。该蛋白经典的四螺旋结构紧密排列在一起，能够使得G蛋白偶联受体的第五和第六个跨膜螺旋在融合后形成相对稳定的构象。传统的BRIL蛋白的分子量过小，不适合直接应用于冷冻电镜结构解析。为了方便利用BRIL融合蛋白进行结构解析，
研究人员也开发了靶向BRIL蛋白的抗体片段，并应用于多个G蛋白偶联受体的结构解析工作
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。由于该抗体片段稳定性较差，表达后容易出现聚集的现象，因此，开发稳定性更好的且能结合BRIL蛋白的纳米抗体，将有助于应用冷冻电镜结构技术进行进行GPCR
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BRIL融合蛋白的解析。
[0006]GPR35(G蛋白偶联受体35，G protein
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coupled receptor 35)是人体GPCR家族的成员之一，其最早于1998年被克隆报道
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。序列分析显示，GPR35与GPR55、溶血磷脂酸受体LPAR4、LPAR5和LPAR6以及烟酸受体HM74有最接近的同源性
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。组织分布研究表明，GPR35在小肠和胰腺组织中有大量分布，其次在结肠、脾脏和免疫细胞(单核细胞、中性粒细胞、T细胞和树突状细胞)中有明显的表达
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。研究表明，GPR35的内源性激动剂可能包括犬尿喹啉酸(kynurenic acid)
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和2
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油酰基
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磷脂酸(2
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oleoyl
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LPA)
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。GPR35与一系列病理状况之间可能存在联系，包括炎症、哮喘、高血压和糖尿病等。因此，GPR35是一个重要的潜在治疗目标
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。开发靶向GPR35的新型激动剂和拮抗剂配体将有助于破译其真正的生理学意义，并为临床开发相关疾病的治疗性药物提供思路。然而，如前所述，临床用药需要开发靶向性的拮抗剂，需要非激活态结构用于AI辅助的基于结构药物开发。同时，GPR35野生型蛋白，柔性较大，稳定性不佳，不适合进行结构研究。针对基于蛋白靶点的DNA编码的小分子库筛选、用于动物免疫产生特异性抗体、以及进行合成纳米抗体库筛选用于开发靶向胞外侧的生物大分子药等多个用途需要更稳定的GPR35。
[0007]因此，针对适合于目的蛋白(尤其是G蛋白偶联受体)融合并用于结构分析的BRIL蛋白仍有待进一步开发，同时针对GPR35仍有待开发稳定性更佳，更适于结构分析的改造型GPR35。

技术实现思路

[0008]专利技术要解决的问题
[0009]针对现有技术中存在的上述问题，本公开开发了一种改造型GPR35，通过本公开提供的改造型mBRIL与GPR35融合形成，并且所形成的融合蛋白可以进一步与抗BRIL纳米抗体形成复合物。本公开提供的改造型GPR35可以用于GPR35的结构解析、靶向性小分子及生物大分子药物开发。
[0010]用于解决问题的方案
[0011]本公开的第一方面提供了一种改造型GPR35，其中，所述改造型GPR35包含以下序列中的一种或多种：
[0012](a1)如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列；
[0013](a2)与SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列具有至少80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且其保留如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的功能；
[0014](a3)在SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并且其保留如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的功能；或者，
[0015](a4)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的多核苷酸序列在严格条件本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种改造型GPR35，其中，所述改造型GPR35包含以下序列中的一种或多种：(a1)如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列；(a2)与SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列具有至少80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且其保留如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的功能；(a3)在SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并且其保留如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的功能；或者，(a4)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交，并且所述氨基酸序列保留以SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的功能，所述严格条件是中等严格条件，中
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高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。2.根据权利要求1所述的改造型GPR35，其中，所述改造型GPR35的N端还包含如SEQ ID NO：33所示的β2肾上腺素受体或其变体。3.根据权利要求2所述的改造型GPR35，其中，所述改造型GPR35包含以下序列中的一种或多种：(b1)如SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列；(b2)与SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列具有至少80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且其保留如SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列的功能；(b3)在SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并且其保留如SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列的功能；或者，(b4)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码如SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交，并且所述氨基酸序列保留以SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列的功能，所述严格条件是中等严格条件，...

【专利技术属性】
技术研发人员：衡杰，肖景景，李小龙，何东，赵爽，吕子霖，黄文茹，李京，倪晓丹，刘玉洁，郭春龙，
申请(专利权)人：水木未来北京科技有限公司，
类型：发明
国别省市：