长效的双靶点嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体、细胞及其应用制造技术

本发明专利技术提供了长效的双靶点嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体、细胞及其应用，所述双靶嵌合抗原受体包含两条独立跨膜蛋白组成的CAR链，第一条CAR链靶向第一靶点的scFv，胞内信号包含第二信号和胞内转导信号或只有胞内转导信号，第二条CAR链靶向第二靶点的scFv，胞内信号包含共刺激信号和JAK酶激活转导域。由本发明专利技术制备的CAR

【技术实现步骤摘要】
长效的双靶点嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体、细胞及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程和免疫治疗
，具体来说，涉及长效的双靶点嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体、细胞及其应用。

技术介绍

[0002]CAR
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T细胞技术是基于免疫系统识别与活化理论，通过基因工程技术，将特异识别肿瘤抗原(单链抗体scFv)、启动免疫活性的元件整合成一个基因，并在体外通过病毒等方法将其转导入患者自身T淋巴细胞中并扩增，之后输回患者体内，使患者重新获得特异性识别肿瘤细胞，激活自身T细胞，有针对性地攻击并杀伤所识别的肿瘤细胞的能力。CAR
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T细胞技术具有对肿瘤杀伤不受主要组织相容性复合体限制等优势，在难治复发的B细胞白血病和淋巴瘤患者中取得了令人振奋的效果，近几年CAR
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T细胞疗法在脑胶质瘤、前列腺癌、肺癌等实体瘤方面的研究也取得了巨大进展，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。迄今，全世界已有300多项CAR
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T细胞疗法进入临床试验。CAR
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T细胞技术的核心就是利用基因工程手段对T细胞进行改造，通过CAR分子识别肿瘤细胞并同时激活T细胞，从而发挥强大杀伤肿瘤细胞的作用。但是，现有的CAR
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T细胞技术治疗肿瘤有着固有缺陷，这是因为现阶段还很难找到肿瘤特异性靶标，主要都是通过肿瘤相关抗原识别肿瘤细胞，不可避免会出现脱靶毒性，甚至严重致死。
[0003]在很多类型肿瘤细胞表面会同时两种靶点蛋白，例如有部分卵巢癌组织同时高表达间皮素(Mesothelin)和B7H3，而正常组织同时高表达两个靶点概率很低，如果将这两个靶点蛋白设计成双靶点CAR，使得CAR
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T细胞同时靶向肿瘤细胞高表达的两个靶点时，CAR
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T细胞才被完全激活，发挥杀伤功能，对正常细胞只表达作为第一激活信号的靶点时或只表达作为第二激活信号的靶点时，CAR
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T细胞则没有杀伤作用或只有较弱的杀伤作用，这样，我们就可以通过合适的双靶点CAR设计可以大大降低体内脱靶毒副作用。
[0004]此外，现有的CAR
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T细胞技术治疗肿瘤还普遍存在体内扩增能力和存续时间不足的缺点，导致临床疗效有限和治疗后容易复发等。解决这个问题，通常利用各种细胞因子实现CAR
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T细胞的持续扩增，如IL
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2、IL
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7、IL
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9、IL
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12、IL
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15、IL
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18、IL
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21，IL
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23、GM
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CSF
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R等，这些细胞因子的作用是通过结合到CAR
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T细胞上细胞因子受体而激活细胞内下游转导信号。例如IL
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15先与IL
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15膜受体的α亚基结合，再与效应CAR
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T细胞上的IL2R
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γc/IL
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15Rβ形成免疫突触，激活细胞内的JAK1/JAK3和STAT3/STAT5途径等，进而促进CAR
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T细胞的分化和增殖。目前有两种方式实现这一目的，第一种，与CAR
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T细胞治疗的同时直接体内注射这些细胞因子，但这种方式如果要达到扩增CAR
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T细胞效果，细胞因子必须大剂量，这必然引起其它免疫细胞的反应，带来不可预知的副作用，甚至导致死亡。第二种，有研究者将CAR设计成在激活扩增CAR
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T细胞的同时分泌细胞因子，可以有效地阻止CAR
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T在体内的耗竭，但是，这种分泌型细胞因子不会仅对自身的CAR细胞起作用，也会游离到体液中，引起体内其它免疫细胞的剧烈反应，带来不可预知的副作用。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：针对CAR
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T细胞技术存在的问题，本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种长效的双靶点嵌合抗原受体，所述双靶点嵌合抗原受体能够降低体内脱靶的毒副作用，通过引入第三信号增强CAR
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T在体内的扩增能力和持久性。
[0006]本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种核酸分子，其编码所述的长效的双靶点嵌合抗原受体。
[0007]本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种载体或包含其的重组病毒。
[0008]本专利技术还要解决的技术问题是提供了所述的长效的双靶点嵌合抗原受体、所述的核酸分子、所述的载体或其重组病毒、或其细胞在制备治疗抗靶点蛋白的阳性表达的实体肿瘤药物中的应用。
[0009]本专利技术最后要解决的技术问题是提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述核酸分子、上述嵌合抗原受体、上述载体或上述细胞，以及药学上接受的载体。
[0010]专利技术目的：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种长效的双靶点嵌合抗原受体，所述长效的双靶点嵌合抗原受体包括两条独立跨膜蛋白组成的嵌合抗原受体，其中，第一条嵌合抗原受体包括第一信号肽、第一靶点肿瘤抗原的结合结构域、第一铰链结构域、第一跨膜结构域、第一胞内共刺激结构域和第一靶点CAR的胞内信号转导域；第二条嵌合抗原受体包括第二信号肽、第二靶点肿瘤抗原的结合结构域、第二铰链结构域、第二跨膜结构域、第二胞内共刺激结构域和JAK酶激活信号转导结构域，所述JAK酶激活信号转导结构域能够捕获JAK酶并激活，所述JAK酶包括JAK1、JAK2或JAK3，所述JAK1的Gene ID为3716，JAK2的Gene ID为3717，JAK3的Gene ID为3718，Tyk2的Gene ID为7297，所述第一条嵌合抗原受体与第二条嵌合抗原受体通过连接子连接。
[0011]其中，所述JAK酶激活信号结构域通过招募JAK激酶并在其催化下发生酪氨酸残基的磷酸化，后续激活STAT信号，进而引发胞内的基因转录和表达，因此，起到与细胞因子异曲同工的作用，一旦能够捕获JAK1、JAK2、JAK3或Tyk2中的任何酶的序列均属于本专利技术的保护范围之内。
[0012]其中，作为优选，所述JAK酶为JAK1酶，所述JAK1酶激活信号转导结构域，其90
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99％同一性的氨基酸序列选自以下一个或者其中两个以上叠加：SEQ ID No.1(JAKAcS1)、SEQ ID No.2(JAKAcS2)、SEQ ID No.3(JAKAcS3)、SEQ ID No.4(JAKAcS4)、SEQ ID No.5(JAKAcS5)、SEQ ID No.6(JAKAcS6)、SEQ ID No.7(JAKAcS7)、SEQ IDNo.8(JAKAcS8)、SEQ IDNo.9(JAKAcS9)、SEQ ID No.10(JAKAcS10)，以上序列均包括JAK1激酶的结合位点和激活信号；以上序列能够捕获JAK1激酶并能够催化其发生氨酸残基的磷本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种长效的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述长效的双靶点嵌合抗原受体包括两条独立跨膜蛋白组成的嵌合抗原受体，其中，第一条嵌合抗原受体包括第一信号肽、第一靶点肿瘤抗原的结合结构域、第一铰链结构域、第一跨膜结构域、第一胞内共刺激结构域和第一靶点CAR的胞内信号转导域；第二条嵌合抗原受体包括第二信号肽、第二靶点肿瘤抗原的结合结构域、第二铰链结构域、第二跨膜结构域、第二胞内共刺激结构域和JAK酶激活信号转导结构域，所述JAK酶激活信号转导结构域能够捕获JAK酶并激活，所述JAK酶包括JAK1、JAK2、JAK3或Tyk2，所述JAK1的Gene ID为3716，JAK2的Gene ID为3717，JAK3的Gene ID为3718，Tyk2的Gene ID为7297，所述第一条嵌合抗原受体与第二条嵌合抗原受体通过连接子连接。2.根据权利要求1所述的长效的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述JAK酶为JAK1酶，所述JAK1酶激活信号转导结构域，其90
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99%同一性的氨基酸序列选自以下一个或者其中两个以上叠加：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10。3.根据权利要求1所述的长效的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一靶点CAR的胞内信号转导域包括以下分子的胞内信号转导结构域：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD40L、CD45、CD66d、CD79、CD80、CD86、CD278、DAP10、DAP12、FcγR或Zap70，优选地，所述第一靶点CAR的胞内信号转导域为CD3ζ信号转导结构域或与其具有90
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99%同一性的氨基酸序列信号转导域，包含的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示。4.根据权利要求1所述的长效的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一信号肽和第二信号肽包括T细胞受体的α链或β链、CD3、CD4、CD5、CD8、CD28、CD33、CD45、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、GM
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CSF、免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链的信号肽或与所述信号肽具有90
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99%同一性的氨基酸序列。5.根据权利要求1所述的长效的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一靶点肿瘤抗原的结合结构域包含肿瘤细胞表面高表达的第一靶点的单链抗体scFv，所述第二靶点肿瘤抗原的结合结构域包含肿瘤细胞表面高表达的第二靶点的单链抗体scFv，所述第一靶点和第二靶点包含Claudin18.2、B7H3、Mesothelin、GPC3、PD
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L1、MUC1、Her2、EGFR、PSMA、CEA、GD2、EpCAM、EGFRvⅢ、CD70、CD20、CD133、CD177、AFP、AXL、CD171、CD117、C
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MET、FAP、MUC16、NKG2D、NY
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ESO
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1、PSCA、VEGFR
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2、Lewis
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Y、Gp100、FAP或...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖忠党，沈杨，孙博，严凯，李占萍，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：