本发明专利技术公开了一种利用硝酸盐和全局厌氧调节因子Fnr提高地衣芽孢杆菌厌氧活性的方法，属于发酵工程领域。本发明专利技术通过向发酵培养基中加入KNO3，提高地衣芽孢杆菌厌氧发酵的活性。进一步通过过表达fnr基因，使地衣芽孢杆菌的菌体量较对照菌株提高了8％，KNO3消耗速率较对照菌株提高了23％，乳酸在24h积累了0.9g/L。本发明专利技术提供的厌氧培养方法工艺简单，为拓宽地衣芽孢杆菌的厌氧发酵应用奠定了理论和实验基础。验基础。验基础。
【技术实现步骤摘要】
一种利用硝酸盐和全局厌氧调节因子Fnr提高地衣芽孢杆菌厌氧活性的方法
[0001]本专利技术涉及一种利用硝酸盐和全局厌氧调节因子Fnr提高地衣芽孢杆菌厌氧活性的方法，属于发酵工程领域。
技术介绍
[0002]地衣芽孢杆菌因其具有抗逆性强、酶系丰富、耐热性好、产酶量高且食品安全性高等众多优势，并且是一个有效的外源基因表达系统，被广泛的应用于天然产物合成工业领域。当前，在实际的工业应用中，地衣芽孢杆菌主要用来生产高温α
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淀粉酶、碱性蛋白酶、杆菌素等化合物。地衣芽孢杆菌分泌的胞外蛋白具有良好的功能稳定性，这是因为其适中的生长速率使得未形成完整构象的蛋白有足够的时间充分折叠；此外，与其他芽孢杆菌相比，地衣芽孢杆菌分泌蛋白质的能力最强，文献报道的最高值可达到20～25g/L。
[0003]溶氧是一种对细胞生长、维持、代谢、产量至关重要的代谢底物。目前工业上的绝大多数产品例如氨基酸、酶制剂以及有机酸等都是通过好氧发酵实现，但由于氧是一种难溶气体，从而导致工业上提升供氧水平很困难，往往需要增加搅拌、增加通风量甚至需要增加罐压等措施，这会导致发酵成本的大大增加，同时好氧发酵过程中还会伴随着大量泡沫的产生，这也导致发酵罐的空间利用率不高。因此氧气的供应往往是工业发酵能否成功的重要限制因素之一。
[0004]厌氧发酵相比于好氧发酵则有很大优势。首先就是厌氧发酵过程中产生的泡沫较少，甚至可以达到一个无泡沫发酵环境，因此发酵罐的填充体积可以达到罐体容积的90％以上，这大大提高了发酵罐的空间利用效率；其次，厌氧发酵过程中不需要高速的搅拌(搅拌仅起混匀的作用)，不用大量通气，或通气为氮气等；发酵罐内也不需要档板等增加溶氧的结构，从而大大降低了设备成本；最后就是厌氧发酵相比于好氧发酵有着底物转化率高的特性，这就可以实现添加的底物能够充分转化为我们需要的产物，且不需要较高的细胞量。鉴于厌氧发酵相比于好氧发酵有诸多优良特性，因此研究地衣芽孢杆菌的厌氧发酵特性以及提高该菌株的厌氧活性是必要且有意义的。
技术实现思路
[0005]目前对地衣芽孢杆菌厌氧生长代谢特性认识的不足，严重阻碍了厌氧发酵工艺的实际应用的难题。
[0006]本专利技术提供了一种提高地衣芽孢杆菌厌氧活性的方法，包括(a)和/或(b)：
[0007](a)在地衣芽孢杆菌中过表达fnr基因；
[0008](b)将地衣芽孢杆菌在含电子受体的培养基中培养；所述电子受体包括KNO3、KNO2、NaNO3、NaNO2中的一种或多种。
[0009]在一种实施方式中，所述fnr基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0010]在一种实施方式中，所述fnr基因基因以P2启动子调控表达；所述P2启动子的核苷
酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]在一种实施方式中，所述地衣芽孢杆菌以大肠杆菌
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枯草芽孢杆菌穿梭质粒pHY
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PLK300为表达载体，表达SEQ ID NO.1所示的fnr基因。
[0012]在一种实施方式中，所述地衣芽孢杆菌以地衣芽孢杆菌CICIM B1391为宿主。
[0013]本专利技术还提供了厌氧活性提高的重组地衣芽孢杆菌，所述重组地衣芽孢杆菌以地衣芽孢杆菌CICIM B1391为宿主，表达SEQ ID NO.2所示的fnr基因。
[0014]在一种实施方式中，所述重组地衣芽孢杆菌以pHY
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PLK300为表达载体，以P2启动子强化fnr基因表达。
[0015]本专利技术还提供所述重组地衣芽孢杆菌在厌氧发酵中的应用。
[0016]在一种实施方式中，所述应用是将所述重组地衣芽孢杆菌在厌氧环境下发酵生产乳酸、乙酸和/或2,3
‑
丁二醇。
[0017]在一种实施方式中，还向发酵培养基中加入KNO3。
[0018]在一种实施方式中，KNO3在培养基中的添加量≥0.5g/L。
[0019]在一种实施方式中，KNO3在培养基中的添加量为0.5～2g/L。
[0020]在一种实施方式中，所述厌氧发酵在35～40℃下发酵。
[0021]有益效果：
[0022](1)本专利技术通过在厌氧血清瓶中建立地衣芽孢杆菌的厌氧培养方法，通过在培养基中添加KNO3，提高菌株的厌氧生长速率，提高菌株的葡萄糖消耗速率、硝酸盐消耗速率，使菌株厌氧发酵96h产生了3.54g/L乳酸，消耗的葡萄糖的量为6.41g/L，糖酸转化率达到理论转化率的55％。
[0023](2)本专利技术还通过在地衣芽孢杆菌中过表达fnr基因，使获得的菌株pHY
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P2‑
fnr/BL2在24h乳酸积累量达0.9g/L，较对照提高了3.5倍。
[0024]本专利技术提供的方法对于开发地衣芽孢杆菌在厌氧发酵相关领域的工业应用具有参考价值。
附图说明
[0025]图1：添加不同电子受体条件下细胞干重(A)、葡萄糖浓度(B)、pH(C)、乳酸浓度(D)、乙酸浓度(E)和2,3
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丁二醇浓度(F)随时间的变化曲线。
[0026]图2：添加不同浓度KNO3条件下细胞干重(A)、葡萄糖浓度(B)、pH(C)、乳酸浓度(D)、乙酸浓度(E)和2,3
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丁二醇浓度(F)随时间的变化曲线。
[0027]图3：pHY
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P2‑
fnr重组质粒构建及fnr基因对硝酸盐还原酶相关基因转录水平的影响；注：M:核酸分子量10000marker；1:pHY
‑
P2
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fnr经Xho I和EcoR I酶切产物。
[0028]图4：pHY
‑
P2‑
fnr/BL2及pHY
‑
/BL2两株菌OD
600
(A)、葡萄糖浓度(B)、pH(C)、KNO3浓度(D)、乳酸浓度(E)、乙酸浓度(F)和2,3
‑
丁二醇浓度(G)随时间的变化曲线。
具体实施方式
[0029]菌株血清瓶厌氧培养方法：
[0030]实验步骤：
①
在250mL血清瓶中装入100mL发酵培养基Ⅰ，分装后115℃灭菌20min；
②
灭菌后按照发酵培养基II，Ⅲ和IV中的成分加入相应的电子供体(葡萄糖)和电子受体，
将LB种子液于5000r/min离心10min收集菌体，用无菌水洗涤三次，将重悬后的菌悬液按一定比例接种于100mL灭菌后的发酵培养基中，使其接种后初始OD
600
保持在0.1
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0.15范围内；
③
厌氧血清瓶用无菌N2以150mL/min的通气速率除氧5min从而达到厌氧状态；
④
37℃恒温静置培养4天，不同时间点通过无菌注射器取样分析。
[0031]细胞干重与OD
600...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种提高地衣芽孢杆菌厌氧活性的方法，其特征在于，包括(a)和/或(b)：(a)在地衣芽孢杆菌中过表达fnr基因；(b)将地衣芽孢杆菌在含电子受体的培养基中培养；所述电子受体包括KNO3、KNO2、NaNO3、NaNO2中的一种或多种。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述fnr基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述fnr基因基因以P2启动子调控表达；所述P2启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌以地衣芽孢杆菌CICIM B1391为宿主。5.一种厌氧活性提高的重组地衣芽孢杆菌，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：李由然，石贵阳，宁雪伟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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