本发明专利技术公开了一种响应蓝光调控的基因表达系统构建及应用，属于合成生物学领域。本发明专利技术通过在解淀粉芽孢杆菌中使用蓝光激活启动子和蓝光抑制启动子对基因的表达进行调控；启动子pBLind在蓝光照射环境下，表达eGFP的水平相较于黑暗环境下提高了1.4倍。启动子pBLrep在蓝光照射环境下，其eGFP表达的水平相较于黑暗环境下降低了10倍，实现了在解淀粉芽孢杆菌中对基因表达的快速、定向、精确调控。精确调控。精确调控。
【技术实现步骤摘要】
一种响应蓝光调控的基因表达系统构建及应用
[0001]本专利技术涉及一种响应蓝光调控的基因表达系统构建及应用，属于合成生物学领域。
技术介绍
[0002]在微生物细胞中，基因表达和细胞周期等基本过程在很大程度上受到空间和时间振荡的控制。对可诱导的和可抑制的基因表达系统进行精确的时空调控将有助于基因在微生物细胞内表达的精细调控，从而避免对宿主细胞造成代谢负担，进而有利于目的产物的高效合成。理想情况下，能够快速而准确地随意“开启”或“关闭”的表达调控系统是有利于提高我们扰乱和调控复杂生物基因网络的能力。通常，使用与可溶性转录因子结合的外源化学诱导剂来实现对基因表达的人工控制。但由于其潜在的非靶向效应、转运过程延迟、毒性和缺乏基因表达的可逆性，它们的效果有限。例如，一旦被诱导，就很难从生长介质中去除残留的化学诱导剂，这给需要在所需水平上精确控制基因表达的研究带来了困难。光刺激是无毒的，可以通过精确的时空控制快速传递到细胞。基因表达水平可以很容易地根据光的强度和光照的持续时间进行调节和逆转。一个理想的光遗传系统需要光依赖的可诱导和可抑制的装置能够与快速和可逆的基因表达在空间和时间上的控制并行工作。这些工具的可用将很好地促进研究者以更可控的方式调节多种内源性基因的表达。
技术实现思路
[0003]本专利技术提出一种蓝光调控基因表达系统及其应用，基于该启动子构建了基于蓝光响应的调控基因表达系统，具体为利用该启动子和开发的基因表达系统在解淀粉芽孢杆菌中对目的基因进行调控。
[0004]本专利技术提供了一种响应蓝光的基因调控表达元件，包括：阻遏蛋白和响应蓝光的启动子；所述阻遏蛋白位于响应蓝光的启动子的上游；所述阻遏蛋白由组成型启动子P
HpaII
表达；所述响应蓝光的启动子含有所述阻遏蛋白的结合序列，所述结合序列如SEQ ID NO.4所示；所述响应蓝光的启动子调控目的基因的表达；所述调控包括激活、促进或抑制。
[0005]在一种实施方式中，所述响应蓝光的启动子含有SEQ ID NO.1或2所示的核苷酸序列。
[0006]在一种实施方式中，所述组成型启动子P
HpaII
的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0007]本专利技术还提供含所述基因调控表达元件的重组表达载体，所述重组表达载体能够允许插入目的基因并使目的基因在微生物细胞中表达。
[0008]在一种实施方式中，所述表达载体包括但不限于质粒pMA5。
[0009]本专利技术还提供含有所述基因调控表达元件或所述重组表达载体的微生物细胞。
[0010]在一种实施方式中，所述微生物细胞包括但不限于细菌细胞或真菌细胞。
[0011]在一种实施方式中，所述细菌包括但不限于：大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
HT plate reader(Winooski,VT,USA)用于检测样品荧光强度。大肠杆菌DH5α用于分子克隆，大肠杆菌GM2163用于去甲基化，解淀粉芽孢杆菌NB(菌株公开于文献《Efficient biosynthesis of low
‑
molecular
‑
weight poly
‑
gamma
‑
glutamic acid based on stereochemistry regulation in Bacillus amyloliquefaciens》)用于蛋白或基因表达。
[0028]实施例中涉及的培养基：
[0029]LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L
[0030]LB固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉2％
[0031]TB液体培养基：酵母粉24g/L，蛋白胨20g/L，KH2PO417 mmol/L，K2HPO472 mmol/L，甘油4mL/L。
[0032]感受态制备培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，山梨醇0.5M
[0033]复苏培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，山梨醇0.5M，甘露醇0.38M
[0034]电击缓冲液：山梨醇0.5M，甘露醇0.5M，甘油10％
[0035]感受态细胞悬浮液：山梨醇0.5M，甘露醇0.5M，甘油10％，PEG
‑
6000 14％
[0036]实施例1响应蓝光的基因调控系统的设计
[0037]响应蓝光的基因调控系统包括阻遏蛋白、蓝光诱导型启动子和目的基因；所述阻遏蛋白位于蓝光诱导型启动子的上游；所述阻遏蛋白由组成型启动子P
HpaII
表达，所述组成型启动子P
HpaII
的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述响应蓝光的启动子含有所述阻遏蛋白的结合序列，所述结合序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述响应蓝光的启动子调控所述目的基因的表达；所述调控包括激活并促进目的基因的表达，或抑制目的基因的表达。
[0038]响应蓝光的基因调控系统的工作原理包括：
[0039](1)当所述蓝光诱导型启动子具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列时，阻遏蛋白结合区位于启动子序列的
‑
35区的上游，在蓝光照射下，阻遏蛋白可招募RNAP至
‑
35和
‑
10区之间，启动目的基因转录(如图3所示)。
[0040](2)当所述蓝光诱导型启动子具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列时，阻遏蛋白结合区位于启动子序列的
‑
35和
‑
10区之间；在蓝光照射下，阻遏蛋白通过阻止RNAP的结合而发挥抑制作用，抑制目的基因的转录(如图4所示)。
[0041]实施例2基因重组载体的构建
[0042]1、由安徽通用生物系统有限公司合成携带有核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的编码光敏蛋白基因的质粒pUC57
‑
EL222。
[0043]2、使用限制性核酸内切酶Nde I和BamH I对质粒pMA5进行双酶切。酶切反应体系为：10
×
Quickcut Buffer 5μL，限制性内切酶Nde I和BamH I各2μL，质粒pMA5总量为41μL，反应体系体积共50μL，在37℃水浴锅中酶切3h，用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
[0044]3、基因片段纯化回收：实验步骤参照Vazyme的DNA纯化回收试剂盒使用说明书，回收线性化的pMA5质粒。
[0045]4、分别将蓝光抑制启动子pBLind和pBLrep置于报告蛋白eGFP的上游，与EL222在质粒pMA5上共表达，具体步骤为：
[0046](1)使用引本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种响应蓝光的基因调控表达元件，其特征在于，包括：阻遏蛋白和响应蓝光的启动子；所述阻遏蛋白位于响应蓝光的启动子的上游；所述响应蓝光的启动子含有SEQ ID NO.1或2所示的核苷酸序列；所述阻遏蛋白由组成型启动子P
HpaII
表达；所述响应蓝光的启动子含有所述阻遏蛋白的结合序列，所述结合序列如SEQ ID NO.4所示；所述响应蓝光的启动子调控目的基因的表达；所述调控包括激活、促进或抑制。2.根据权利要求1所述的基因调控表达元件，其特征在于，所述组成型启动子P
HpaII
的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。3.含有权利要求1或2所述基因调控表达元件的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体能够允许插入目的基因并使目的基因在微生物细胞中表达。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体包括质粒pMA5。5.含有权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗正山，朱逸凡，徐虹，韩瑞，严一凡，杜姗姗，刘召琼，李莎，王瑞，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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