高产丰原素的枯草芽孢杆菌菌株及构建方法技术

本发明专利技术公开了高产丰原素的枯草芽孢杆菌菌株及构建方法,步骤：利用CRISPR/Cas9技术敲除菌株CGF01的srfAB

【技术实现步骤摘要】
高产丰原素的枯草芽孢杆菌菌株及构建方法


[0001]本专利技术属于枯草芽孢杆菌基因工程领域，具体涉及高产丰原素的枯草芽孢杆菌菌株及构建方法及用途。

技术介绍

[0002]丰原素是芽孢杆菌通过非核糖体肽合成途径合成的一种环状脂肽，由10个α
‑
氨基酸和一个侧链长度为14
‑
21个碳原子的β
‑
羟基脂肪酸组成。合成丰原素的非核糖体肽合成酶系包含fenA，fenB，fenC，fenD，fenE(或ppsA
‑
ppsE)五个操纵子。丰原素对丝状真菌有特异性抑制作用，具有抗真菌、抗肿瘤、抗病毒等作用，在生物医药方面以及生物防治方面有较广泛的应用。
[0003]然而，丰原素的低产量限制了其应用，目前主要通过替换启动子、优化培养基组分及条件等方式提高其产量。Yaseen等将Bacillus subtilis BBG111的P
pps
启动子替换为B.subtilis BBG21的P
fen
启动子，得到菌株B.subtilis BBG203，其丰原素产量从1.4
±
0.5mg/L提高至11.5
±
1.46mg/L，提高了大约8倍(Yaseen Y,Gancel F,Drider D,B
é
chet M,Jacques P.Influence of promoters on the production of fengycin in Bacillus spp[J].Research in Microbiology,2016,167(4):272
‑
281.)。Lu等探讨果糖、阿拉伯糖和山梨醇对解淀粉芽孢杆菌fmb
‑
60生产丰原素的影响，结果显示果糖最有效地提高了细胞中合成丰原素所需的必需氨基酸成分的浓度，丰原素最大产量为392.87mg/L(Lu H,Qian S,Muhammad U,Jiang X,Han J,Lu Z.Effect of fructose on promoting fengycin biosynthesis in Bacillus amyloliquefaciens fmb
‑
60[J].Journal of Applied Microbiology,2016,121(6):1653
‑
1664.)。
[0004]脂肪酸是丰原素合成中的重要前体物质。谭维等(CN113278644A)强化丙二酰辅酶A合成途径的相关基因(acs、birA和accACD)，丰原素产量提升为24.73mg/L。靳佳琦等(CN113969258A)阻断脂肪酸β氧化分解代谢基因fadB、强化脂肪酸酰基辅酶A基因yhfL表达、构建生物素羧化酶yngH、硫酯酶tesA过表达菌株表达菌株，最终丰原素产量达到212.36mg/L。然而，脂肪酸途径中涉及的其它基因(accBC和fabHB)目前在丰原素合成中没被探究。
[0005]生物膜的形成需要消耗能量，阻断生物膜的形成可以使能量进行重新分配。相关研究表明敲除tasA
‑
sipW
‑
yqxM基因簇和eps基因簇有效提高srfA基因的转录，从而促进表面活性素的合成(L
ó
pez D,Vlamakis H,Losick R,Kolter R.Paracrine signaling in a bacterium[J].Genes&Development,2009,23(14):1631
‑
1638)。敲除孢子形成相关基因spoIIIE促进表面活性素的合成(Wang MM,Yu HM,Li X,Shen ZY.Single
‑
gene regulated non
‑
spore
‑
forming Bacillus subtilis:Construction,transcriptome responses,and applications for producing enzymes and surfactin[J].Metabolic Engineering,2020,62:235
‑
248)。然而，阻断生物膜和孢子形成对于丰原素的影响目前没有研究。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种高产丰原素的枯草芽孢杆菌菌株。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供高产丰原素的枯草芽孢杆菌菌株的构建方法。
[0008]本专利技术的第三个目的是提供高产丰原素的枯草芽孢杆菌菌株的用途。
[0009]本专利技术的第四个目的是提供第二种高产丰原素的枯草芽孢杆菌菌株。
[0010]本专利技术的第五个目的是提供第二种高产丰原素的枯草芽孢杆菌菌株的构建方法。
[0011]本专利技术的第六个目的是提供第二种高产丰原素的枯草芽孢杆菌菌株的用途。
[0012]本专利技术的第七个目的是提供第三种高产丰原素的枯草芽孢杆菌菌株。
[0013]本专利技术的第八个目的是提供第三种高产丰原素的枯草芽孢杆菌菌株的构建方法。
[0014]本专利技术的第九个目的是提供第三种高产丰原素的枯草芽孢杆菌菌株的用途。
[0015]本专利技术的技术方案概述如下：
[0016]一种高产丰原素的枯草芽孢杆菌菌株的构建方法，包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9技术敲除菌株CGF01的srfAB
‑
srfAC基因片段，敲除pksBCDE基因片段，用P
veg
启动子替换天然启动子P
fenC
，得到高产丰原素的枯草芽孢杆菌菌株，命名为CGF04；
[0017]所述srfAB
‑
srfAC基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0018]所述pksBCDE基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0019]所述的P
veg
启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0020]所述的P
fenC
启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0021]上述方法构建的高产丰原素的枯草芽孢杆菌CGF04。
[0022]上述枯草芽孢杆菌发酵生产丰原素的用途。
[0023]第二种高产丰原素的枯草芽孢杆菌菌株的构建方法，包括如下步骤：对菌株CGF04利用P43启动子过表达乙酰辅酶A羧化酶基因accBC和3
‑
氧酰基
‑
ACP合酶III基因fabHB，得到高产丰原素的枯草芽孢杆菌菌株，命名为CGF16；所述基因accBC由基因accB和基因accC组成；
[0024]所述P43启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0025]上述方法构建的高产丰原素的枯草芽孢杆菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产丰原素的枯草芽孢杆菌菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9技术敲除菌株CGF01的srfAB
‑
srfAC基因片段，敲除pksBCDE基因片段，用P
veg
启动子替换天然启动子P
fenC
，得到高产丰原素的枯草芽孢杆菌菌株，命名为CGF04；所述srfAB
‑
srfAC基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述pksBCDE基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的P
veg
启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述的P
fenC
启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.权利要求1的方法构建的高产丰原素的枯草芽孢杆菌CGF04。3.权利要求2所述枯草芽孢杆菌发酵生产丰原素的用途。4.一种高产丰原素的枯草芽孢杆菌菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：对菌株CGF04利用...

【专利技术属性】
技术研发人员：程景胜，高庚荣，丁明珠，元英进，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：