一种提高了谷氨酸脱羧酶酶活的地衣芽胞杆菌工程菌的构建方法及应用技术

本发明专利技术属于基因工程和酶工程领域，公开了一种提高了谷氨酸脱羧酶酶活的地衣芽胞杆菌工程菌的构建方法及应用。申请人强化了地衣芽胞杆菌DW2内源二硫键氧化还原酶，并在地衣芽胞杆菌基因组上整合了二硫键氧化还原酶。将GAD的编码基因与二硫键异构酶进行共表达，成功构建了能够高表达谷氨酸脱羧酶的重组质粒。将其转入上述构建好的地衣芽胞杆菌DW2底盘细胞中进行高效表达，得到了能够提高谷氨酸脱羧酶酶活的重组工程菌，GAD酶活达到57.6 U

【技术实现步骤摘要】
一种提高了谷氨酸脱羧酶酶活的地衣芽胞杆菌工程菌的构建方法及应用


[0001]本专利技术属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种提高了谷氨酸脱羧酶酶活的地衣芽胞杆菌工程菌的构建方法及应用。

技术介绍

[0002]γ
‑
氨基丁酸(GABA)是一种抑制性神经递质，在食品、医药和畜牧行业均有广泛的应用，常用于食品添加剂、生理药物以及饲料添加剂等(Sarasa et al.,Curr.Microbiol,2020,77(4):534
‑
544)。GABA常见的合成方法主要有4种方式，分别是化学合成法、植物富集法、微生物发酵法和全细胞催化法(Baritugo,K.A.,Microb Cell Fact,2018,17(1):129)。但是受到苛刻的反应条件及昂贵的天然原料的限制，利用化学合成法生产GABA安全性较差、有化学残留；植物富集法虽然安全性好，但制得的GABA浓度太低，无法作为医药、食品添加剂。目前制备GABA主要是利用大肠杆菌高效表达谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase，GAD)后经全细胞催化法、不可逆地脱去L
‑
谷氨酸的α
‑
羧基，从而得到高浓度高纯度的GABA(Tang et al.,Int J Biol Macromol,2020,160:372
‑
379)。但是大肠杆菌不属于食品安全菌株，而且在发酵过程中容易感染噬菌体，对工业生产造成巨大的损失。
[0003]全细胞催化可以使GAD在最适的pH条件下催化合成GABA，摆脱了酸碱性对GABA生产的限制，进而实现高效催化。由于GAD是六聚体，且每个单体含有三对二硫键，因此该酶在胞内的有效酶活受限，而全细胞催化中所必须的是能够表达高酶活谷氨酸脱羧酶的微生物细胞，因此有效提高GAD的酶活已成为研究的关键突破。之前的研究中提高谷氨酸脱羧酶酶活的方法大多数都是采用定点突变(Zhang et al.,Molecules,2020,25:690；Hua et al.,Appl BiochemBiotechnol,2020,191(4):1456
‑
1469)。
[0004]地衣芽胞杆菌是一株重要的工业生产菌株，具有高效的蛋白表达能力，且被美国FDA认定为生物安全性菌株，可作为目标蛋白的优良宿主。
[0005]含二硫键的酶，理论上可以通过不同的二硫键相关酶来提高酶活，但由于每个酶的构象差异，也并不清楚哪些二硫键相关酶适用于目标酶。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供了一种提高了谷氨酸脱羧酶酶活的地衣芽胞杆菌工程菌的构建方法。
[0007]本专利技术的另一个目的在于提供了上述地衣芽孢杆菌工程菌在生产谷氨酸脱羧酶中的应用。
[0008]为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：
[0009]一种提高了谷氨酸脱羧酶酶活的地衣芽胞杆菌工程菌的构建方法，首先强化地衣芽胞杆菌中的内源二硫键氧化还原酶bdbCD(NC_021362.1)，然后在地衣芽胞杆菌中整合来源于大肠杆菌的二硫键氧化还原酶dsbA(SEQ ID NO.4所示)，最后将来源于大肠杆菌的谷
16.43g
·
L
‑1、KH2PO
4 2.31g
·
L
‑1，PH 7.0。
[0026]全细胞催化缓冲体系：磷酸吡哆醛(PLP)0.1mmol
·
L
‑1、L
‑
谷氨酸2mol
·
L
‑1。
[0027]下述实施例中涉及的检测方法如下：
[0028]重组谷氨酸脱羧酶(GAD)酶活测定：
[0029]重组GAD粗酶液的获取：
[0030]按照取1mL的发酵液离心收集菌体，用含有0.15mmol
·
L
‑1PLP的50mmol
·
L
‑1pH 5.0Na2HPO4‑
柠檬酸缓冲液复溶菌体并加入终浓度为0.6mg
·
mL
‑1的溶菌酶，在37℃反应30min后，置于冰水中超声破碎(超声功率25％，时间10min)，12000r
·
min
‑1离心5min得破壁上清即为GAD粗酶液。
[0031]重组GAD粗酶液酶活性的测定：
[0032]底物溶液配制：0.1mol
·
L
‑1L
‑
谷氨酸和0.15mmol
·
L
‑1PLP溶于50mmol
·
L
‑1pH 4.5Na2HPO4‑
柠檬酸缓冲液中，置于4℃避光保存；反应体系：将装有360μL底物溶液的1.5mL EP管于37℃水浴锅预热10min后，加入40μL GAD粗酶液，在37℃下反应4min，加入600μL 0.2mol
·
L
‑1pH 10硼酸缓冲液终止反应，置于沸水中灭活10min；GABA含量测定：使用HPLC
‑
OPA氨基酸柱前衍生法检测GABA生成量。
[0033]酶活定义：1min催化底物转化生成1μmol GABA所需的酶量为一个活力单位(U)。
[0034]酶活计算公式：酶活(U
·
mL
‑1)＝转化生成的γ
‑
氨基丁酸的量(μmol
·
mL
‑1)/转化时间(min)。
[0035]γ
‑
氨基丁酸(GABA)含量及转化率的检测方法：
[0036]采用HPLC测定样品中的GABA含量测定前，首先对样品进行衍生化，衍生化条件如下，将100μL样品稀释液，200μL 0.5mol
·
L
‑1Na2CO3‑
NaHCO3缓冲液，100μL 80g
·
L
‑1丹磺酰氯溶液混合后，置于80℃下避光衍生40分钟。将衍生后的样品用0.22μm的微孔滤膜进行过滤。
[0037]HPLC操作条件如下：色谱分离柱为Hypersil ODS2 C18(250mm
×
4.6mm)，紫外检测波长为254nm，进样量为20μL，流动相A为甲醇，流动相B为四氢呋喃：甲醇：0.05mol
·
L
‑1醋酸钠(pH 6.2)(5:75:420,V/V)。
[0038]根据吸收峰面积和GABA标准品峰面积计算生成的GABA产量。
[0039]GABA转化率(％)＝GABA实际生成的摩尔数/谷氨酸转化生成GABA的理论摩尔数
×
100。
[0040]实施例1：
[0041]谷氨酸脱羧酶GAD和二硫键异构酶PDI的共表达重组质粒的构建
[0042]1、以质粒pHY300PLK为模板，以300
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高了谷氨酸脱羧酶酶活的地衣芽胞杆菌工程菌的构建方法，包括以下步骤：首先强化地衣芽胞杆菌中的内源二硫键氧化还原酶NC_021362.1，然后在地衣芽胞杆菌中整合来源于大肠杆菌的二硫键氧化还原酶，最后将来源于大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶和来源于毕赤酵母的二硫键异构酶PDI的共表达载体，转入上述地衣芽胞杆菌中；所述的来源于大肠杆菌的二硫键氧化还原酶dsbA为SEQ ID NO.4所示；所述的谷氨酸脱羧酶基因为SEQ ID NO.1所示，毕赤酵母中的二硫键异构酶PDI基因为SEQ ID NO.2所示；所述的地衣...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，赵毅雯，王世依，毛树分，王冬，马昕，
申请(专利权)人：·，
类型：发明
国别省市：