一种缩短同源臂长度的枯草芽孢杆菌基因组编辑方法技术

本发明专利技术公开了一种枯草芽孢杆菌基因组编辑方法，属于基因工程领域。本发明专利技术以枯草芽孢杆菌作为表达宿主，将单链DNA结合蛋白和DNA退火蛋白整合至枯草芽孢杆菌基因组中，得到重组枯草芽孢杆菌，其中，单链DNA结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，DNA退火蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过在枯草芽孢杆菌基因组中整合表达单链DNA结合蛋白和DNA退火蛋白，可将枯草芽孢杆菌基因组整合同源臂长度缩短至35bp，为枯草芽孢杆菌内实现高效简易的基因编辑提供了工具。基因编辑提供了工具。基因编辑提供了工具。

【技术实现步骤摘要】
一种缩短同源臂长度的枯草芽孢杆菌基因组编辑方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种缩短同源臂长度的枯草芽孢杆菌基因组编辑方法。

技术介绍

[0002]枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是革兰氏阳性模型微生物，具有遗传背景清晰、遗传操作简单、易培养、不易污染噬菌体、不含内毒素和分泌蛋白能力强等诸多优势。同时，其被美国食品和药物管理局(FDA)认可为安全(GRAS)食品级微生物。但是，相比于大肠杆菌遗传转化操作所需的50bp长度的同源臂，枯草芽孢杆菌常用同源臂长度为500
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1500bp，这大大增加了整合框构建的难度。若将同源臂长度降低至50bp，则可将同源臂直接使用引物引入，降低整合框构建难度。但目前并未有相关报道，因此，亟需开发针对枯草芽孢杆菌的缩短同源臂的高效同源重组方法。

技术实现思路

[0003]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种缩短同源臂长度的枯草芽孢杆菌基因组编辑方法，是通过提前在基因组整合表达DNA结合蛋白和DNA退火蛋白，并使用IPTG诱导型启动子进行诱导，再结合枯草芽孢杆菌高效转化方法实现。
[0004]本专利技术的第一个目的是提供一种缩短同源臂长度的枯草芽孢杆菌基因组编辑方法，包括以下步骤：
[0005]将单链DNA结合蛋白和DNA退火蛋白整合至枯草芽孢杆菌基因组中，所述单链DNA结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述DNA退火蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0006]具体地，SEQ ID NO.1序列为：
[0007]MASRGVNKVILVGNLGQDPEVRYMPNGGAVANITLATSESWRDKATGEMKEQTEWHRVVLFGKLAEVASEYLRKGSQVYIEGQLRTRKWTDQSGQDRYTTEVVVNVGGTMQMLGGRQGGGAPAGGNIGGGQPQGGWGQPQQPQGGNQFSGGAQSRPQQSAPAAPSNEPPMDFDDDIPF；
[0008]SEQ ID NO.2序列为：
[0009]MNQIVKFTDDSGLAVQVTPDDVRRYICENATEKEVGLFLQLCQTQRLNPFVKDAYLVKYGGAPASMITSYQVFNRRACRDANYDGIKSGVVVLRDGDVVHKRGAACYKKAGEELIGGWAEVRFKDGRETAYAEVALDDYSTGKSNWAKMPGVMIEKCAKAAAWRLAFPDTFQGMYAAEEMDQAQQPEQVRAQAEQPVDLQPIRELFKPYCEHFGITPAEGMTAVCGAVGAEGMHSMTEQQARRARAWMEEEMAAPAVEAEYEVVDEGEVF。
[0010]进一步地，所述单链DNA结合蛋白和DNA退火蛋白由异丙基
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β
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D
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硫代半乳糖苷诱导表达。
[0011]本专利技术的第二个目的是提供一种DNA结合蛋白和DNA退火蛋白表达盒，所述表达盒中包括来源于大肠杆菌的单链DNA结合蛋白以及来源于放线菌噬菌体的DNA退火蛋白；其中，所述来源于大肠杆菌的单链DNA结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述来源
于放线菌噬菌体的DNA退火蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0012]进一步地，所述DNA结合蛋白和DNA退火蛋白表达盒中还包括位于单链DNA结合蛋白和DNA退火蛋白上游的IPTG诱导表达框。
[0013]进一步地，所述IPTG诱导表达框包括IPTG诱导型启动子和阻遏蛋白LacI。该表达盒由异丙基
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β
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D
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硫代半乳糖苷诱导表达，即由异丙基
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β
‑
D
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硫代半乳糖苷诱导表达为由IPTG诱导型启动子和IPTG诱导型启动子阻遏蛋白LacI调控表达。
[0014]进一步地，所述IPTG诱导型启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0015]进一步地，所述阻遏蛋白LacI的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0016]本专利技术的第三个目的是提供一种高效同源重组的重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌为出发菌，整合了上述DNA结合蛋白和DNA退火蛋白表达盒。
[0017]进一步地，所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法包括以下步骤：将ComK蛋白整合至枯草芽孢杆菌中，将该重组菌株制备成感受态细胞后，整合上述DNA结合蛋白和DNA退火蛋白表达盒，得到所述重组枯草芽孢杆菌。
[0018]进一步地，编码所述ComK蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。具体序列如下：
[0019]atgagtcagaaaacagacgcacctttagaatcgtatgaagtgaacggcgcaacaattgccgtgctgccaga
[0020]agaaatagacggcaaaatctgttccaaaattattgaaaaagattgcgtgttttatgtaaacatgaagccgctgcaaatt
[0021]gtcgacagaagctgccgattttttggatcaagctatgcgggaagaaaagcaggaacttatgaagtgacaaaaatttc
[0022]acacaagccgccgatcatggtggacccttcgaaccaaatctttttattccctacactttcttcgacaagaccccaatgc
[0023]ggctggatttcccatgtgcatgtaaaagaattcaaagcgactgaattcgacgatacggaagtgacgttttccaatggg
[0024]aaaacgatggagctgccgatctcttataattcgttcgagaaccaggtataccgaacagcgtggctcagaaccaaatt
[0025]ccaagacagaatcgaccaccgcgtgccgaaaagacaggaatttatgctgtacccgaaagaagagcggacgaaga
[0026]tgatttatgattttattttgcgtgagctcggggaacggtattag
[0027]进一步地，所述ComK蛋白通过诱导型启动子调控表达，所述诱导型启动子可为任何适用于宿主的启动子，如本专利技术中使用的是木糖诱导启动子，通过木糖诱导型启动子P
xylA
调控表达，所述枯草芽孢杆菌宿主基因组上使用木糖诱导型启动子P
xylA
在基因组上过表达一个额外拷贝的comK基因。
[0028]进一步地，所述木糖诱导型启动子P
xylA
的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。具体序列如下：
[0029]tttttttactaa本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种缩短同源臂长度的枯草芽孢杆菌基因组编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：将单链DNA结合蛋白和DNA退火蛋白整合至枯草芽孢杆菌基因组中，所述单链DNA结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述DNA退火蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌基因组编辑方法，其特征在于：所述单链DNA结合蛋白和DNA退火蛋白由异丙基
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β
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D
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硫代半乳糖苷诱导表达。3.一种DNA结合蛋白和DNA退火蛋白表达盒，其特征在于：包括来源于大肠杆菌的单链DNA结合蛋白以及来源于放线菌噬菌体的DNA退火蛋白；其中，所述来源于大肠杆菌的单链DNA结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述来源于放线菌噬菌体的DNA退火蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求3所述的DNA结合蛋白和DNA退火蛋白表达盒，其特征在于：所述DNA结合蛋白和DNA退火蛋白表达盒中还包括位于单链DNA结合蛋白和DNA退火蛋白上游的IPTG诱导表达框，所述IPTG诱导表达框包括IPTG诱导型启动子和阻遏蛋白LacI。5.根据权利要求4所述的DNA结合蛋白和DNA退火蛋白表达盒，其特征在于：所述IPTG诱导型启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述阻遏蛋白LacI的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。6.一种高效同源重组的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘延峰，陈坚，刘龙，堵国成，李江华，吕雪芹，田荣臻，
申请(专利权)人：嘉兴未来食品研究院，
类型：发明
国别省市：