一种谷氨酰激酶的表达调控序列及其应用制造技术

本发明专利技术提供的具有表达调控活性的多核苷酸，核苷酸序列如序列SEQ ID NO：3

【技术实现步骤摘要】
一种谷氨酰激酶的表达调控序列及其应用


[0001]本专利技术属于生物技术和基因工程
，具体涉及一种具有表达调控活性的多核苷酸，包含具有表达调控活性的多核苷酸的转录表达盒、重组表达载体、重组宿主细胞，以及增强目标基因表达的方法、制备氨基酸尤其是脯氨酸的方法。

技术介绍

[0002]L
‑
脯氨酸，是天然存在的一种人体的非必需氨基酸，在临床、生物材料和工业等方面有广泛的应用。目前，主要以微生物发酵法生产L
‑
脯氨酸，由于谷氨酸棒杆菌的生理优越性，已成为工业中最重要的生产菌株。
[0003]在谷氨酸棒杆菌中，主要以谷氨酸为底物经过γ
‑
谷氨酰激酶（Glutamate
‑5‑
kinase，ProB）、谷氨酸半醛脱氢酶（Glutamate
‑
semialdehyde dehydrogenase，ProA）、吡咯啉
‑5‑
羧酸还原酶（Pyrroline
‑5‑
carboxylic acid reductase，ProC）催化后生产 L
‑
脯氨酸。现有技术表明，ProB是提高L
‑
脯氨酸产量的关键，如 CN101084312A 报道了谷氨酸棒杆菌来源的ProB蛋白的 149位突变可以解除 L
‑
脯氨酸的反馈抑制，提高工程菌株 L
‑
脯氨酸的产量。同时，专利技术人前期的工作也表明采用强启动子表达ProB也有助于L
‑<br/>脯氨酸产量的提高（Nat Commun. 2022 Feb 16;13(1):891.），然而，现有技术中，仍缺乏在谷氨酸棒杆菌中可以更加高效表达ProB的表达调控元件。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中缺乏在谷氨酸棒杆菌中可以更加高效表达ProB的表达调控元件的问题，本专利技术通过对已知的表达调控元件进行改造，获得了能够在谷氨酸棒杆菌中更高效稳定表达ProB的表达元件，在此基础上完成本专利技术。本专利技术的
技术实现思路
如下：第一方面，提供一种具有表达调控活性的多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自如下（i）
‑
（iv）中的任一项：（i）包含如SEQ ID NO.3
‑
5任一项所示的核苷酸序列；（ii）包含如SEQ ID NO.3
‑
5所示的核苷酸序列的反向互补序列；（iii）在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与（i）或（ii）所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；（iv）与（i）或（ii）所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性；且最后五个核苷酸残基保持不变。
[0005]第二方面，提供一种转录表达盒，其中，包含第一方面所述的具有表达调控活性的多核苷酸；可选地，所述转录表达盒还含有蛋白编码基因，所述蛋白编码基因与所述具有启动子活性的多核苷酸可操作地连接。
[0006]第三方面，提供一种重组表达载体，其中，包含第一方面所述的具有表达调控活性的多核苷酸，或第二方面所述的转录表达盒。所谓的表达盒就是包括启动子和下游基因的序列，启动子和基因之前可以是直接链接，也可以在增加一些间隔区序列，如SD序列等等，
都是为了增强表达强度的。
[0007]第四方面，提供一种重组微生物宿主细胞，其中，包含第二方面所述的转录表达盒，或者第三方面所述的重组表达载体。
[0008]在本专利技术一个优选的实施方案中，所述的重组微生物宿主细胞来源于棒状杆菌属；优选地，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌。
[0009]第五方面，提供第一方面所述的具有表达调控活性的多核苷酸、第二方面所述的转录表达盒、第三方面所述的重组表达载体，或者第四方面所述的重组宿主细胞在如下至少一种中的用途:（i）制备用于增强基因转录水平的试剂或试剂盒；（ii）制备蛋白，或制备用于制备蛋白的试剂或试剂盒；优选地，所述蛋白为氨基酸合成的相关酶；进一步优选地，所述蛋白为谷氨酰激酶ProB；更优选地，所述谷氨酰激酶ProB为解除了L
‑
脯氨酸反馈抑制的谷氨酰激酶。
[0010]（iii）生产氨基酸；优选地，所述氨基酸为脯氨酸、羟脯氨酸。
[0011]第六方面，提供一种增强目标基因表达的方法，其中，所述方法包括将第一方面所述的具有表达调控活性的多核苷酸与目标基因可操作地连接的步骤。
[0012]第七方面，提供一种制备蛋白的方法，其中，选择第二方面所述的转录表达盒，第三方面所述的重组表达载体，或第四方面所述的重组宿主细胞表达所述蛋白；可选地，所述蛋白为谷氨酰激酶ProB。
[0013]第八方面，提供一种生产氨基酸的方法，其中，选择第一方面所述的多核苷酸，第二方面所述的转录表达盒，第三方面所述的重组表达载体，或第四方面所述的重组宿主细胞表达氨基酸合成的相关酶，在所述氨基酸合成的相关酶存在下生产所述氨基酸，任选地，该方法还包括分离或纯化氨基酸的步骤；优选地，所述氨基酸为脯氨酸、羟脯氨酸，所述氨基酸合成的相关酶为谷氨酰激酶ProB。进一步优选地，所述谷氨酰激酶ProB为解除了L
‑
脯氨酸反馈抑制的谷氨酰激酶。
[0014]本专利技术的有益效果：本专利技术提供的具有表达调控活性的多核苷酸，核苷酸序列如序列SEQ ID NO：3
‑
5任一项所示，是表达调控活性显著提高的谷氨酸棒杆菌来源的表达调控元件的突变体。与野生型表达调控元件相比，突变体的表达调控活性显著提高，将其与目标基因可操作地连接，可以显著提高目标基因的表达强度，且不会破坏基因组的稳定性，使目标基因能够稳定高效表达，进而稳定、高效的生产下游产物。
[0015]由此，本专利技术提供的生产氨基酸的方法，利用上述具有表达调控活性的多核苷酸，能够提高氨基酸合成的相关酶的表达，进而稳定、高效的生产氨基酸。当用于脯氨酸或反式
‑4‑
羟基
‑
L
‑
脯氨酸生产时，能够获得稳定高产的脯氨酸或反式
‑4‑
羟基
‑
L
‑
脯氨酸。
[0016]附图说明
[0017]图1.pEC
‑
rfp
‑
1质粒的质粒图谱。
[0018]具体实施方式
[0019]下文将结合具体实施例对本专利技术的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本专利技术，而不应被解释为对本专利技术保护范围的限制。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均涵盖在本专利技术旨在保护的范围内。
[0020]除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有表达调控活性的多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自如下（i）
‑
（iv）中的任一项：（i）包含如SEQ ID NO.3
‑
5任一项所示的核苷酸序列；（ii）包含如SEQ ID NO.3
‑
5任一项所示的核苷酸序列的反向互补序列；（iii）在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与（i）或（ii）所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；且最后五个核苷酸残基保持不变；（iv）与（i）或（ii）所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性；且最后五个核苷酸残基保持不变。2.一种转录表达盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的具有表达调控活性的多核苷酸；可选地，所述转录表达盒还含有与所述具有启动子活性的多核苷酸可操作地连接的蛋白编码基因。3.一种重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求1所述的具有表达调控活性的多核苷酸，或如权利要求2所述的转录表达盒。4.一种重组微生物宿主细胞，其中，包含如权利要求2所述的转录表达盒，或者如权利要求3所述的重组表达载体；优选地，所述的重组微生物宿主细胞来源于棒状杆菌属；优选地，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌。5.如权利要求1所述的具有表达调控活性的多核苷酸、如权利要求2所述的转录表达盒、如权利要求3所述的重组表达载体，或者如权利要求4所述的重组微生物宿...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑平，刘娇，孙际宾，周文娟，刘建行，孙冠男，乔倩倩，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：