一种芳香族酰胺生物传感器的创制与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种芳香族酰胺生物传感器的创制与应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术中的生物传感器，是在来源于铜绿假单胞菌的(Pseudomonasaeruginosa)的转录调节因子AmiC

【技术实现步骤摘要】
一种芳香族酰胺生物传感器的创制与应用


[0001]本专利技术涉及一种芳香族酰胺生物传感器的创制与应用，属于生物工程


技术介绍

[0002]酰胺是一类含氮的羧酸衍生物，在构造上，酰胺可看作是羧酸分子中羧基的羟基被氨基或烃氨基(
‑
NHR或
‑
NR2)取代而成的化合物；也可看作是氨或胺分子中氮原子上的氢被酰基取代而成的化合物。主要用作工业溶剂，医药工业上用于生产维生素、激素，也用于制造杀虫脒。烟酰胺是一种十分重要的化合物。在工业中，可以作为营养性添加剂，具有抗老化，提高皮肤抵抗力等功效，广泛的应用于化妆品行业；在医药中被用于防治糙皮病及口炎、舌炎等病症的治疗。异烟酰胺是头孢类药物的中间体，在医药行业具有重要地位。
[0003]生物传感器(biosensor)，是一种可以快速响应环境中的目标物质并将其浓度转化为便于辨认的信号，如电信号、颜色等，人们可以根据接收到的信号来判断目标物质的有无以及含量的多少。
[0004]烟酰胺作为一种无色、无臭的化合物，溶于溶剂中之后很难检测，目前最常用的检测手段就是高效液相色谱，但是这种方法成本比较高，而且耗费时间。此外烟酰胺的检测还可以使用比色法，但是这种方法易受其他物质干扰，灵敏度比较低，误差比较严重。同时，其他的芳香族酰胺类化合物也和烟酰胺存在着同样的问题，检测难度大、对检测的浓度要求高。因此目前还缺少一种可以从复杂环境中高效、准确的检测芳香族酰胺类化合物、尤其是烟酰胺的手段。

技术实现思路

[0005]针对现有的技术难点及存在的问题，本专利技术提供了一种来源于铜绿假单胞菌的(Pseudomonas aeruginosa)的转录调节因子AmiC
‑
AmiR的氨基酸基序及其在检测芳香族酰胺的应用。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种酰胺类物质的生物传感器，所述生物感应器包含带有RBS
AmiC
序列的AmiC结构单元和带有RBS
AmiR
序列的AmiR结构单元；其中，AmiC结构单元的是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的原AmiC结构单元基础上将第83位的酪氨酸突变为异亮氨酸，将233位苏氨酸突变为半胱氨酸，是与酰胺结合的配体结合域。
[0007]在一种实施方式中，所述生物传感器中的基因沿基因表达的方向依次为RBS
AmiC
、AmiC结构单元基因、RBS
AmiR
、AmiR结构单元基因。
[0008]在一种实施方式中，所述AmiC结构单元的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]在一种实施方式中，所述AmiR结构单元的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010]在一种实施方式中，所述RBS
AmiC
序列如SEQ ID NO.4所示。
[0011]在一种实施方式中，所述RBS
AmiR
序列如SEQ ID NO.5所示。
[0012]在一种实施方式中，所述酰胺类物质包括异丁酰胺、戊酰胺、丙烯酰胺、烟酰胺、吡嗪酰胺、萘甲酰、苯甲酰胺和肉桂酰胺。
[0013]本专利技术的第二个目的是提供携带上述生物传感器的质粒。
[0014]在一种实施方式中，所述质粒包括pET系列载体，所述pET系列载体上携带标记基因。
[0015]在一种实施方式中，所述pET系列载体包括pET24a。
[0016]在一种实施方式中，所述标记基因包括编码荧光蛋白的基因。
[0017]在一种实施方式中，所述荧光蛋白包括绿色荧光蛋白GFP。
[0018]本专利技术的第二个目的是提供携带上述生物传感器或上述质粒的细胞。
[0019]在一种实施方式中，所述细胞包括大肠杆菌。
[0020]在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α、E.coli TOP10中的任一种。
[0021]本专利技术第四个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主，携带上述生物传感器或上述质粒。
[0022]所述大肠杆菌包括E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α、E.coli TOP10中的任一种。
[0023]本专利技术的第五个目的是提供上述生物传感器或上述质粒或上述细胞或上述基因工程菌在芳香族酰胺检测或筛选代谢芳香族酰胺的菌株或研究芳香族酰胺生产代谢通路方面的应用。
[0024]有益效果：
[0025]本专利技术提供了一种可以响应芳香族酰胺的生物传感器，是在来源于铜绿假单胞菌的(Pseudomonas aeruginosa)的转录调节因子AmiC
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AmiR的氨基酸基序的基础上，分别对AmiC和AmiR的RBS进行优化，并将AmiC第83位的酪氨酸突变为异亮氨酸，将233位苏氨酸突变为半胱氨酸。本专利技术提供的生物传感器相较与野生型转录调节因子AmiC
‑
AmiR对于芳香族酰胺的响应能力从不响应变为响应，经过RBS的优化使其响应能力具有了良好的线性关系，响应范围在0～10mM之间。本专利技术提供的可以响应芳香族酰胺的生物传感器可用于芳香族酰胺的检测、筛选代谢芳香族酰胺的菌株或为后续研究芳香族酰胺生产代谢通路打下基础，具有广泛的应用场景。
附图说明
[0026]图1为野生型与突变体对于不同物质的特异性检验。
[0027]图2为Y83I/T233C对于不同浓度烟酰胺的响应验证。
具体实施方式
[0028]LB培养基：胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，NaCl 10.0g/L，卡那霉素终浓度50μg/mL。
[0029]表1引物序列
MultifSeamlessAssembly Mix进行连接。连接产物转化E.coli DH5α，阳性转化子的基因序列由安升达(苏州)有限公司进行测序验证，测序正确的质粒命名为pVEO
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AmiC
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AmiR
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WT。
[0038]实施例2：野生型AmiC
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AmiR的RBS的优化
[0039]根据实施例1中构建的野生型质粒pVEO
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AmiC
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AmiR
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WT，分别对AmiC和AmiR的RBS进行建库筛选，建库方法以野生型质粒pVEO
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AmiC
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AmiR
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WT为模板，使用简并引物，RBSNNN
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S
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F/RBSNNN
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S
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R，RBSNNN
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F/RBSNNN
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R(表1)通过PCR分别扩增出目的DNA片段，这两对简本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酰胺类物质的生物传感器，其特征在于，所述生物感应器包含带有RBS
AmiC
序列的AmiC结构单元和带有RBS
AmiR
序列的AmiR结构单元；其中，AmiC结构单元的是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的基础上将第83位的酪氨酸突变为异亮氨酸，将233位苏氨酸突变为半胱氨酸；所述生物传感器中的基因沿基因表达的方向依次为RBS
AmiC
、AmiC结构单元基因、RBS
AmiR
、AmiR结构单元基因；所述AmiR结构单元的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述RBS
AmiC
序列如SEQ ID NO.4所示，所述RBS
AmiR
序列如SEQ ID NO.5所示。2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述酰胺类物质包括异丁酰胺、戊酰胺、丙烯酰胺、烟酰胺、吡嗪酰胺、萘甲酰、苯甲酰胺和肉桂酰胺。3.携带权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：周哲敏，浦卫锋，张广林，程中一，崔文璟，
申请(专利权)人：无锡新晨宇生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：