一种悬钩子属种间杂交种质的鉴定方法及鉴定用引物技术

本发明专利技术公开了一种悬钩子种间杂交种质的鉴定方法，包括以下步骤：以六倍体栽培黑莓为母本，以二倍体野生悬钩子为父本，获取杂交种子，培育获得种间杂交苗；设计父本SSR引物，对种间杂交苗DNA进行扩增，筛选引物组合鉴别出真杂交种；将筛选出的SSR引物对在野生悬钩子、树莓、黑莓品种中进行扩增条带验证，优选出鉴别不同野生悬钩子父本杂交后代的特异引物。用筛选出的SSR引物对黑莓栽培品种和悬钩子种间杂交苗进行鉴定，根据扩增条带鉴别真杂交种和确认亲本种质来源。本发明专利技术首次实现将二倍体野生悬钩子与六倍体栽培黑莓品种杂交成功，利用筛选获得的SSR分子标记进行杂交种鉴别，并验证了野生种质通过杂交进入栽培品种。证了野生种质通过杂交进入栽培品种。证了野生种质通过杂交进入栽培品种。

【技术实现步骤摘要】
一种悬钩子属种间杂交种质的鉴定方法及鉴定用引物


[0001]本专利技术属于植物育种
，涉及一种将野生悬钩子种质导入栽培品种创制新种质的方法和鉴定技术。

技术介绍

[0002]黑莓是一种原产于欧美国家的小浆果果树，自1986年引入国内后为低山丘陵地区农业和产业发展做出重要贡献。近年来，由于黑莓成熟期迟易遭遇梅雨、品种老化、品质不突出、适应性差等问题显现，黑莓产业可持续发展出现了一系列问题，加上知识产权壁垒难以定向引进优良品种，利用现有品种及野生悬钩子种质开展早熟且鲜食品质突出的黑莓品种选育迫在眉睫。不同悬钩子属植物遗传背景复杂，不仅不同倍性种质杂交亲和性低，而且后代表型变异大不易根据表型判断是否为杂交种质，为杂交育种开展带来了很多局限性。
[0003]广泛开展杂交育种实践是创制黑莓新种质的关键措施，近年来迫切需要寻找杂交亲和力高的亲本及其杂交配制方法。近年来在两年生黑莓结果类型基础上市场上推出开花期更早和果实极成熟(5月20号前后)的双季黑莓。尽管其在丰产性和早熟方面具明显优势，但果实口感偏酸，食用品质亟待提高。通过跨倍性杂交技术探索和杂交种质筛选，有望选育出果实鲜食和营养品质突出的早熟或极早熟黑莓品种。
[0004]通过人工杂交和分子标记辅助鉴别方法实现快速创制悬钩子属种间杂交新种质成为一种可能，目前尚未见将野生悬钩子种质和栽培品种杂交成功实现集双亲性状于一体的报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了克服现有技术中不同倍性悬钩子种质杂交不亲和和鉴别技术缺乏的难题，提供一种经过杂交培育和鉴定确认成功获得悬钩子种间杂交种质的技术方法。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0007]一种悬钩子种间杂交种质的鉴定方法，包括以下步骤：
[0008](1)获取杂交种子：以六倍体栽培黑莓为母本，以二倍体野生悬钩子为父本，进行人工杂交后获得种子；将种子进行培育获得种间杂交苗木；
[0009](2)引物设计：采集父本幼嫩叶片进行转录组测序，设计若干对SSR引物；
[0010](3)引物筛选和种质鉴别：将步骤(2)设计的SSR引物对步骤(1)中所有获得的种间杂交苗木进行验证筛选，依据扩增带型鉴别出杂交成功的真杂交种，并筛选出能够鉴别出真杂交种的特异SSR引物；
[0011](4)扩增验证：将步骤(3)中筛选出的SSR引物进一步在其他野生悬钩子、树莓、黑莓品种中进行扩增验证，进而获得能够区分不同野生悬钩子亲本杂交后代的引物；
[0012](5)杂交种质鉴定：将步骤(4)中进一步筛选出的SSR引物对种间杂交幼苗进行分子标记鉴定，能够扩增出条带的即为真杂交种。
[0013]本专利技术采用六倍体栽培黑莓为母本、二倍体野生悬钩子为父本进行杂交，成功获得杂交种质，为SSR分子标记进行杂交种鉴别提供了可行性。进一步筛选出SSR引物验证野生种质通过杂交进入栽培品种，同时对真杂种的鉴别更为准确、易于操作。
[0014]在部分实施例中，作为优选的，六倍体栽培黑莓选自黑莓品种
‘
双季黑莓
’
，二倍体野生悬钩子选自
‘
蓬蘽
’
。通过对六倍体栽培黑莓及二倍体野生悬钩子品种的选取，成功获得杂交种质。
[0015]在部分实施例中，作为优选的，步骤(4)中进行扩增验证采用的野生悬钩子为
‘
蓬蘽
’
、
‘
山莓
’
、
‘
掌叶覆盆子
’
，树莓品种为黄树莓、红树莓、黑树莓，黑莓品种为
‘
Kiowa
’
、
‘
Boysen
’
、
‘
Hull
’
、
‘
Arapaho
’
、
‘
Navaho
’
、
‘
早黑
’
。
[0016]本专利技术通过将筛选出的SSR引物于多品种的野生悬钩子、树莓、黑莓进行扩增比较验证，进一步筛选出能够区分不同野生悬钩子亲本来源杂交后代的引物，进一步提高了对悬钩子属种间杂交种质的鉴定准确性。
[0017]基于上述鉴定方法，本专利技术还提供了一种悬钩子种间真杂交种鉴定用SSR引物Rh
‑
11、Rh
‑
20、Rh
‑
21、Rh
‑
34，Rh
‑
11正向引物为5
’‑
CGGTGCCTCTCTCTCTCTCT
‑3’
,Rh
‑
11反向引物为5
’‑
CGGAACCAAACCCATCATCG
‑3’
；Rh
‑
20正向引物为5
’‑
AAAGACCCAGCTATGTGCCC
‑3’
,Rh
‑
20反向引物为5
’‑
GCTTTTGCACAAAGAGGAAGA
‑3’
；Rh
‑
21正向引物为5
’‑
AATCCAGCTCATGTGCCTCA
‑3’
，Rh
‑
21反向引物为5
’‑
TCTGTCGGACTGCAGACAAC
‑3’
；Rh
‑
34正向引物为5
’‑
CTCTCTCCTCTGCCCCTCTT
‑3’
，Rh
‑
34反向引物为5
’‑
CTCTTATCCTCGCCGTCGAC
‑3’
。以上四种引物可用于扩增鉴别不同倍性悬钩子种质杂交成功的呈共显性多态SSR引物。
[0018]本专利技术还提供了一种悬钩子种间杂交种质鉴别用SSR引物Rh
‑
2、Rh
‑
3、Rh
‑
4、Rh
‑
16，Rh
‑
2正向引物为5
’‑
AAGCGCGACAACGAAAAGAC
‑3’
,Rh
‑
2反向引物为5
’‑
ACAAGTAAAGCATGCAACAGGT
‑3’
；Rh
‑
3正向引物为5
’‑
TGGCACACAGTCACACAGAT
‑3’
,Rh
‑
3反向引物为5
’‑
TCTGCCTCTGGTTTCCTTTCC
‑3’
；Rh
‑
4正向引物为5
’‑
CTCACACCCGTCTGCTTCAT
‑3’
，Rh
‑
4反向引物为5
’‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种悬钩子种间杂交种质的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获取杂交种子：以六倍体栽培黑莓为母本，以二倍体野生悬钩子为父本，进行人工杂交后获得种子；将种子进行培育获得种间杂交苗木；(2)引物设计：采集父本幼嫩叶片进行转录组测序，设计若干对SSR引物；(3)引物筛选：将步骤(2)设计的SSR引物对步骤(1)中所有获得的种间杂交苗木进行验证筛选，利用在双亲中扩增的带型鉴别出杂交成功的真杂交种质，并筛选出能够鉴别出真杂交种的特异SSR引物；(4)扩增验证：将步骤(3)中筛选出的鉴别真杂交种质的特异SSR引物进一步在其他野生悬钩子、树莓、黑莓品种中进行扩增比较验证，进一步确认能够特异识别来自不同野生悬钩子亲本的杂交种质的引物；(5)杂交种质鉴定：将步骤(4)中进一步筛选出的SSR引物对种间杂交幼苗进行分子标记鉴定，能够扩增出条带的即为真杂交种。2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述六倍体栽培黑莓选自黑莓品种
‘
双季黑莓
’
，二倍体野生悬钩子选自
‘
蓬蘽
’
。3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤(4)中进行扩增验证采用的野生悬钩子为
‘
蓬蘽
’
、
‘
山莓
’
、
‘
掌叶覆盆子
’
，树莓品种为黄树莓、红树莓、黑树莓，黑莓品种为
‘
Kiowa
’
、
‘
Boysen
’
、
‘
Hull
’
、
‘
Arapaho
’
、
‘
Navaho
’
、
‘
早黑
’
。4.一种悬钩子种间真杂交种质鉴定用SSR引物Rh
‑
11、Rh
‑
20、Rh
‑
21、Rh
‑
34，Rh
‑
11正向引物为5
’‑
CGGTGCCTCTCTCTCTCTCT
‑3’
,Rh
‑
11反向引物为5
’‑
CGGAACCAAACCCATCATCG
‑3’
；Rh
‑
20正向引物为5
’‑

【专利技术属性】
技术研发人员：张春红，吴文龙，吴雅琼，闾连飞，黄正金，王小敏，杨海燕，
申请(专利权)人：江苏省中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：