一种高活性腈水合酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高活性腈水合酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术通过对来源于温泉热碱芽孢杆菌TA2.A1的腈水合酶的进行改造，具体为将其β亚基的第47位氨基酸进行突变，构建得到的突变体N47F的酶活为592.92

【技术实现步骤摘要】
一种高活性腈水合酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及一种高活性腈水合酶突变体及其应用，具体涉及一种腈水合酶的氨基酸基序、含有编码该氨基酸序列的基因的质粒、转化后含有该质粒的菌株及其在改善腈水合酶上的应用，属于生物工程


技术介绍

[0002]腈水合酶(Nitrile hydratase，简称NHase，EC 4.2.1.84)，可以将腈类底物水合，从而转化为相应的酰胺类产物。玫瑰色红球菌J1(节杆菌属)来源的该酶是人们首次发现并报道的腈水合酶。目前生产腈水合酶的微生物有红球菌属(Rhodococccus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和短杆菌属(Brevibacterium)等，且其异源表达已在大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、毕赤酵母(Pichia pastoris)等模式菌株中实现。随着对腈水合酶研究的深入，条件温和、选择性强的生物催化法正逐步替代化学合成法，成功应用于工业生产丙烯酰胺、烟酰胺和5
‑
氰基戊酰胺等酰胺类产品。
[0003]酰胺类产品具有较高的工业价值，其中，烟酰胺是一种重要的化工生产原料，用途广泛。烟酰胺本身为维生素B12的辅酶，可以作为维生素补剂，还可用来合成多种维生素衍生物，市场前景广阔。然而，目前腈水合酶的工业应用仍然存在一定的问题。由于腈的水合是放热反应，这就要求腈水合酶具有较好的热稳定性才能在高温下维持高反应速率。与此相悖的是，大多数的腈水合酶在温度超过50℃时会迅速失活，因此，获取兼具较高酶活和良好热稳定性的腈水合酶具有重要意义。
[0004]温泉热碱芽孢杆菌(Caldalkalibacillusthermarum TA2.A1)来源的腈水合酶具有较好的热稳定性，该酶在65℃的半衰期为3h，具有优异的热稳定性，但野生型的催化酶活较低。因此，提高该腈水合酶的催化活性具有极大的应用价值和广阔的应用前景。

技术实现思路

[0005]针对现有的技术难点及存在的问题，本专利技术提供了一种来源于温泉热碱芽孢杆菌(Caldalkalibacillusthermarum TA2.A1)的腈水合酶的突变体氨基酸基序及其在底物催化生产上的应用。
[0006]本专利技术体提供了一种高活性腈水合酶突变体，所述腈水合酶由α亚基、β亚基以及调控蛋白组成；所述突变体是将β亚基第47位的氨基酸取代成苯丙氨酸；所述α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述调控蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0007]本专利技术提供了编码所述腈水合酶突变体的基因。
[0008]本专利技术提供了含有所述基因的表达载体。
[0009]在一种实施方式中，所述表达载体包括但不限于pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列载体。
[0010]优选的，以pET
‑
24a(+)为表达质粒载体
[0011]本专利技术提供了携带权利要求2所述基因或权利要求3或4所述重组载体的微生物细胞。
[0012]在一种实施方式中，所述微生物细胞以大肠杆菌为宿主。
[0013]在一种实施方式中，所述微生物细胞是以大肠杆菌BL21为宿主。
[0014]本专利技术提供了一种提高腈水合酶酶活力的方法，所述方法是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的腈水合酶β亚基第47位天冬酰胺突变为苯丙氨酸；所述腈水合酶还包含α亚基和调控蛋白；所述α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述调控蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0015]本专利技术提供了一种生产腈水合酶突变体的方法，其特征在于，将所述微生物细胞接种于YT培养基中，在35～37℃、180～200rpm下培养至OD
600
为0.6～0.8时，加入终浓度为0.1～0.4mM的IPTG和终浓度为0.0.5～0.2g/L的CoCl2·
6H2O，在22～24℃诱导12～16h，即得到含有腈水合酶突变体的发酵液。
[0016]本专利技术提供了所述腈水合酶突变体、所述基因、所述微生物细胞在生产酰胺类物质中的应用。
[0017]在一种实施方式中，所述酰胺类物质包括但不限于烟酰胺及其衍生物或是丙烯酰胺及其衍生物。
[0018]有益效果：
[0019]本专利技术通过对来源于温泉热碱芽孢杆菌TA2.A1的腈水合酶的进行改造，具体为将其β亚基的第47位氨基酸进行突变，构建得到的突变体N47F的酶活为592.92
±
1.12U/mg，与未进行改造的野生型腈水合酶的比酶活165.30
±
1.21U/mg相比，有明显提高，约为野生型的3.6倍，显著改善腈水合酶催化活性，有利于应用于工业上精细化学品如烟酰胺的生产，提高催化效率，降低生产成本。
附图说明
[0020]图1为纯酶的SDS
‑
PAGE电泳图，M：蛋白Marker，1：WT，2：N47F。
[0021]图2为Cal.t NHase野生酶WT与突变体N47F的比酶活。
具体实施方式
[0022]1、培养基：
[0023]LB培养基(L
‑1)：胰蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母提取物5g，pH 7.0，配制固体培养基时添加琼脂粉20g。
[0024]无甘油TB培养基(L
‑1)：胰蛋白胨12g，酵母提取物24g，KH2PO
4 2.31g，K2HPO
4 12.54g。
[0025]2、缓冲液：
[0026]结合缓冲液：20mM Na2HPO4·
12H2O，280mM NaCl，6mM KCl，pH 7.4
[0027]洗脱缓冲液：20mM Na2HPO4·
12H2O，280mM NaCl，6mM KCl，2.5mM d
‑
Desthiobiotin，pH 7.4。
[0028]腈水合酶的酶活力(U)：单位酶活力定义为25℃下，每分钟催化烟腈生成1μmol烟酰胺所需要的酶量。
[0029]腈水合酶的比酶活(U/mg)：每毫克腈水合酶所具有的酶活力。
[0030]实施例1：腈水合酶突变体的质粒构建
[0031]根据本实验室已有Cal.t NHase的野生型质粒pET24a(+)
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Cal.t WT(具体构建步骤公开于文献张赛兰,李婷,程中一等.新型耐热腈水合酶的异源表达及其催化工艺研究[J].食品与发酵工业,2020,第46卷(14):108
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113)，采用全质粒PCR的方法构建了突变体质粒pET24a(+)
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N47F。首先以质粒pET24a(+)
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Cal.t WT为模板，突变序列设计在引物上，通过PCR扩增出碱基序列发生突变的质粒，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高活性腈水合酶突变体，其特征在于，所述腈水合酶由α亚基、β亚基以及调控蛋白组成；所述突变体是将β亚基第47位的氨基酸取代成苯丙氨酸；所述α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述调控蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.编码权利要求1所述腈水合酶突变体的基因。3.含有权利要求2所述基因的表达载体。4.根据权利要求3所述表达载体，其特征在于，所述表达载体包括但不限于pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列载体。5.携带权利要求2所述基因或权利要求3或4所述重组载体的微生物细胞。6.如权利要求5所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞以大肠杆菌为宿主。7.一种提高腈水合酶酶活力的方法，其特征在于，所述方法是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的腈水合酶β亚基第47位天冬...

【专利技术属性】
技术研发人员：周哲敏，程中一，崔文璟，浦卫峰，张广林，
申请(专利权)人：无锡新晨宇生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：