一种腈水合酶底物通道氨基酸基序的改造用于肉桂酰胺的制备制造技术

本发明专利技术公开了一种腈水合酶底物通道氨基酸基序的改造用于肉桂酰胺的制备，属于生物工程技术领域。本发明专利技术通过将所述腈水合酶β亚基上的第37位的苯丙氨酸、第48号位的亮氨酸和/或α亚基上的第89位谷氨酰胺进行突变，得到突变体F37P

【技术实现步骤摘要】
一种腈水合酶底物通道氨基酸基序的改造用于肉桂酰胺的制备


[0001]本专利技术涉及一种腈水合酶底物通道氨基酸基序的改造用于肉桂酰胺的制备，属于生物工程


技术介绍

[0002]携带独特酰胺基团的酰胺类物质，拥有特殊的生理功能和潜在的生物活性，是合成大量精细化工品、多聚体和合成中间体的优势资源。目前，已经开发了许多合成方法用于酰胺类物质的制备。肉桂酰胺及其衍生物的合成就是其中经典的案例，它们可以作为很多天然产物的载体支架。比如，这类支架可以作为有效的模板用于设计和生产新型的具有药理活性的药物类分子。目前，肉桂酰胺及其衍生物的获取在工业生产中主要还是以传统的化学合成为主，有关生物酶法催化的文献报道非常少。在化学法生产过程中，操作比较繁琐，并且需要极端温度、强碱、有毒试剂三乙胺等。这些苛刻的反应条件安全系数低，与绿色生产理念不一致，急需改善。
[0003]腈类是合成中的宝贵中间体，它们可以较为容易地从许多简单、直接和经济高效的合成方法中获得。腈水合酶(Nitrilehydratase，简称NHase，EC4.2.1.84)，是一类可以催化腈类物质通过水合反应转化为高附加值酰胺类化合物的金属酶，在烟酰胺和丙烯酰胺的工业生产上已经被广泛应用。目前，酰胺类的生物法生产技术以其绿色环保、反应条件温和、安全系数高等优势，而逐渐替代传统的化学法，符合可持续发展和绿色生产理念。
[0004]腈水合酶通常由α和β两个亚基构成，研究发现，目前已报道的原核生物来源的腈水合酶大都存在稳定性差、催化活性低、催化底物谱窄的问题。也有很多研究尝试对其进行了改造，来提高其相关的性质。但是目前的催化效率不高、底物谱窄等问题仍然限制着腈水合酶进一步的开发和应用。尤其是对于像肉桂腈这样较大位阻的底物，活性更低。

技术实现思路

[0005]针对现有的技术难点及存在的问题，本专利技术通过对来源于嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)的腈水合酶的底物通道氨基酸进行改造，以期能拓宽底物谱并提升催化性能。
[0006]本专利技术提供了一种腈水合酶突变体，所述腈水合酶包含α亚基和β亚基，以来源于Pseudonocardia thermophila的腈水合酶PtNHase为亲本；所述腈水合酶亲本的α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述突变体为将β亚基的第37苯丙氨酸、β亚基的第48位亮氨酸或α亚基的第89位谷氨酰胺中的至少一处进行突变。
[0007]在一种实施方式中，所述突变体为如下(a)～(e)任一所述：
[0008](a)所述突变体为将β亚基的第37位苯丙氨酸和第48位亮氨酸突变发生取代；
[0009](b)所述突变体为将α亚基的第89位谷氨酰胺突变发生取代；
[0010](c)所述突变体为将β亚基的第37位苯丙氨酸、第48位亮氨酸和将α亚基的第89位谷氨酰胺突变发生取代；
[0011](d)所述突变体为将β亚基的第37位苯丙氨酸和将α亚基的第89位谷氨酰胺突变发生取代；
[0012](e)所述突变体为将β亚基的第48位亮氨酸和将α亚基的第89位谷氨酰胺突变发生取代。
[0013]在一种实施方式中，所述突变体为将β亚基的第37位突变为脯氨酸或缬氨酸，第48位突变为丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、精氨酸或苏氨酸。
[0014]在一种实施方式中，所述突变体为将β亚基的第37位突变为脯氨酸，第48位突变为丙氨酸脯氨酸或苏氨酸。
[0015]在一种实施方式中，所述突变体为将α亚基的第89位突变为半胱氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、缬氨酸。
[0016]在一种实施方式中，所述突变体为将α亚基的第89位突变为天冬酰胺。
[0017]本专利技术提供了编码所述突变体的基因。
[0018]本专利技术提供了携带所述基因的重组质粒。
[0019]在一种实施方式中，所述重组质粒以pET系列为表达载体。
[0020]在一种实施方式中，所述重组质粒以pET
‑
24a(+)为表达载体。
[0021]本专利技术提供了表达所述突变体，或含有所述基因的宿主细胞。
[0022]在一种实施方式中，所述宿主细胞包含原核或真核微生物。
[0023]在一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
[0024]在一种实施方式中，所述宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。
[0025]本专利技术提供了一种重组菌株，所述重组菌株表达所述腈水合酶突变体。
[0026]在一种实施方式中，所述重组菌株以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为宿主，以pET
‑
24a(+)为表达载体。
[0027]本专利技术提供了一种提高腈水合酶催化活性的方法，所述方法为以来源于Pseudonocardia thermophila的腈水合酶PtNHase为亲本；所述腈水合酶亲本的α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述突变体为将β亚基的第37苯丙氨酸、β亚基的第48位亮氨酸或α亚基的第89位谷氨酰胺中的至少一种进行突变。
[0028]在一种实施方式中，所述方法为如下(a)～(e)任一所述：
[0029](a)所述方法为将β亚基的第37位苯丙氨酸和第48位亮氨酸突变发生取代；
[0030](b)所述方法为将α亚基的第89位谷氨酰胺突变发生取代；
[0031](c)所述方法为将β亚基的第37位苯丙氨酸、第48位亮氨酸和将α亚基的第89位谷氨酰胺突变发生取代；
[0032](d)所述方法为将β亚基的第37位苯丙氨酸和将α亚基的第89位谷氨酰胺突变发生取代；
[0033](e)所述方法为将β亚基的第48位亮氨酸和将α亚基的第89位谷氨酰胺突变发生取代。
[0034]在一种实施方式中，所述方法为将β亚基的第37位突变为脯氨酸或缬氨酸，第48位
突变为丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、精氨酸或苏氨酸。
[0035]在一种实施方式中，所述方法为将β亚基的第37位突变为脯氨酸，第48位突变为丙氨酸、脯氨酸或苏氨酸。
[0036]在一种实施方式中，所述方法为将α亚基的第89位突变为半胱氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、缬氨酸。
[0037]在一种实施方式中，所述方法为将α亚基的第89位突变为天冬酰胺。
[0038]本专利技术提供了一种制备肉桂酰胺的方法，所述方法是以肉桂腈为底物，利用所述腈水合酶突变体催化生成肉桂酰胺。
[0039]本专利技术还提供了所述腈水合酶突变体，或所述基因，或所述重组质粒，或所述宿主细胞在制备肉桂酰胺中的应用。
[0040]在一种实施方式中，表达载体上的基因连接顺序依次为编码β亚基基因、编码α亚基基因、编码调控蛋白基因。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种腈水合酶突变体，其特征在于，所述腈水合酶包含α亚基和β亚基，以来源于Pseudonocardia thermophila的腈水合酶PtNHase为亲本；所述腈水合酶亲本的α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述突变体为将β亚基的第37位苯丙氨酸、β亚基的第48位亮氨酸或α亚基的第89位谷氨酰胺中的至少一处进行突变。2.根据权利要求1所述腈水合酶突变体，其特征在于，所述突变体为将β亚基的第37位突变为脯氨酸或缬氨酸，第48位突变为丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、精氨酸或苏氨酸；所述突变体为将α亚基的第89位突变为半胱氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、缬氨酸。3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。4.携带权利要求3所述基因的重组质粒。5.表达权利要求1或2所述突变体，或含有权利要求3所述基因的宿主细胞。6.一种重组菌株，其特征在于，表达权利要求1或2所述腈水合酶突变体。7.一种提高腈水合酶催化...

【专利技术属性】
技术研发人员：周哲敏，程中一，浦卫锋，张广林，
申请(专利权)人：无锡新晨宇生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：