谷氨酸脱羧酶突变体H465W及其在γ-氨基丁酸生产中的应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程和酶工程领域，公开了谷氨酸脱羧酶突变体H465W及其在γ

【技术实现步骤摘要】
谷氨酸脱羧酶突变体H465W及其在
γ
‑
氨基丁酸生产中的应用


[0001]本专利技术属于酶工程和基因工程领域，具体涉及谷氨酸脱羧酶突变体H465W及其在γ
‑
氨基丁酸生产中的应用。

技术介绍

[0002]γ
‑
氨基丁酸(GABA)是一种4
‑
碳非蛋白质氨基酸，其在食品、农业、医药和其他领域均具有广泛的应用。(Xu et al.,2017；Sarasa et al.,Curr.Microbiol,2020,77(4):534
‑
544)。大量研究表明，GABA是一种广泛存在于哺乳动物中枢神经系统中的抑制性神经递质，具有许多重要的生理功能，如利尿、调节血压、镇静作用等(Baritugo,K.A.,Microb Cell Fact,2018,17(1):129)。此外，在生化工业中，GABA也被用于合成工业产品，如2
‑
吡咯烷酮和可生物降解的聚酰胺尼龙4。
[0003]目前，γ
‑
氨基丁酸生产包括化学合成法、植物富集法和微生物合成法等。但是受到苛刻的反应条件及昂贵的天然原料的限制，利用化学合成法生产GABA安全性较差、有化学残留；植物富集法虽然安全性好，但制得的GABA浓度太低，无法作为医药、食品添加剂。谷氨酸脱羧酶(GAD)(EC 4.1.1.15)能不可逆地催化L
‑
谷氨酸(盐)转化生成γ
‑
氨基丁酸，是生物转化法合成γ
‑
氨基丁酸的关键酶制剂，具有巨大的市场应用价值。
[0004]近些年来，大量不同来源的谷氨酸脱羧酶被克隆并表征，如：大肠杆菌来源的GadB，巨大芽孢杆菌来源的GadB，乳酸杆菌的GadA和GadB等。然而，GAD的嗜酸性和低酶活限制了其在工业上的应用。因此，探索和鉴定性能优良、活性高的新型GADs是非常有必要的。Jun等通过优化GadB(Escherichia coli)的N端结构域，提高了其热稳定性。Fang等通过对短乳杆菌CGMCC No.1306和Thermococcus kodakarensis的GAD同源序列比对，在GAD的13个残基位置引入脯氨酸，获得了耐热性较高的突变酶G364P。但是，目前国内外已报道的谷氨酸脱羧酶一般催化效率较低，尤其是在偏中性条件下，这一特性已经严重影响了其在工业上的应用前景。
[0005]因此，通过筛选或定向突变改造谷氨酸脱羧酶，获得在不同pH条件下具有较高催化活力的GAD，并基于此构建高效生物催化系统，为工业化应用于高产γ
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氨基丁酸提供基础。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种谷氨酸脱羧酶突变体H465W，所述突变体为SEQ ID NO.3所示。
[0007]本专利技术的另一个目的在于提供了谷氨酸脱羧酶突变体H465W在催化生产γ
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氨基丁酸中的应用。
[0008]为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：
[0009]申请人将来源于大肠杆菌(Escherichia coli str.K
‑
12 substr.MG1655NC_000913.3)的野生型谷氨酸脱羧酶第465位氨基酸由组氨酸H突变为色氨酸W，得到了本专利技术
的谷氨酸脱羧酶突变体H465W，为SEQ ID NO.3所示。
[0010]本专利技术的保护内容还包括：编码SEQ ID NO.3所示蛋白的基因。
[0011]以上所述的基因优选的，为SEQ ID NO.4所示。
[0012]表达SEQ ID NO.3所示蛋白的重组菌株。
[0013]以上所述的重组菌株，是将谷氨酸脱羧酶突变体H465W的表达载体转化进地衣芽胞杆菌所得。
[0014]所述的地衣芽孢杆菌为用于表达外源蛋白的地衣芽胞杆菌；优选的为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)DW2。
[0015]一种高效生产γ
‑
氨基丁酸的方法，包括下述步骤：
[0016]100mL全细胞催化缓冲液中、加入4～5g/L全细胞催化用菌泥，底物谷氨酸浓度为1～2mol
·
L
‑1，控制反应过程中pH为4.5～5.0；反应条件为37℃～40℃，120～150r
·
min
‑1。
[0017]所述的全细胞催化用菌泥中的有效菌株为表达SEQ ID NO.3所示蛋白的重组菌株；所述的全细胞催化缓冲液为磷酸吡哆醛(PLP)0.1mmol
·
L
‑1、L
‑
谷氨酸1mol
·
L
‑1。
[0018]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0019]本专利技术通过定点突变的方式，将谷氨酸脱羧酶分子C端结构域的第465位组氨酸突变为色氨酸(本专利技术命名为突变体H465W)，显著提高了谷氨酸脱羧酶的酶活力，能够大大提高其产γ
‑
氨基丁酸的能力，通过谷氨酸脱羧酶的活性测定分析，发现相较于野生型谷氨酸脱羧酶，本专利技术的谷氨酸脱羧酶突变体H465W在不同pH条件下都表现出明显提高的酶活性，提示其更适合工业化生产。通过实验表明，基于表达谷氨酸脱羧酶突变体的地衣芽胞杆菌重组菌株具有优良的γ
‑
氨基丁酸生产能力，1M底物全细胞催化反应4h后，转化液中γ
‑
氨基丁酸的含量可达100g/L，底物摩尔转化率为97％，相比于含有未突变谷氨酸脱羧酶基因的重组菌具有更好的工业化应用前景。
附图说明
[0020]图1为突变体和野生型不同条件下的催化活性比较。
[0021]图2为突变体工程菌全细胞催化后产物含量。
具体实施方式
[0022]本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。为使本专利技术技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步的详细说明，但并不构成对本专利技术的限制。
[0023]下述实施例中涉及的培养基如下：
[0024]LB液体培养基：酵母粉5g
·
L
‑1、蛋白胨10g
·
L
‑1、NaCl 10g
·
L
‑1，PH 7.0。
[0025]LB固体培养基：酵母粉5g
·
L
‑1、蛋白胨10g
·
L
‑1、NaCl 10g
·
L
‑1、琼脂粉15g
·
L
‑1。
[0026]TB液体培养基：酵母粉24g
·
L
‑1、蛋白胨12g
·
L
‑1、甘油5g
·
L
‑1、K2HPO4·
3H2O 16.4 3g
·...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.谷氨酸脱羧酶突变体，所述的突变体为SEQ ID NO.3所示。2.编码SEQ ID NO.3所示蛋白的基因。3.根据权利要求2所述的基因，为SEQ ID NO.4所示。4.表达SEQ ID NO.3所示蛋白的重组菌株。5.根据权权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，是将表达权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶突变体的表达载体转化进地衣芽胞杆菌所得。6.根据权利要求5所述的重组菌株，所述的地衣芽孢杆菌地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniform...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，王世依，赵毅雯，毛树分，王冬，马昕，
申请(专利权)人：武汉守鹏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：