一种褐藻胶裂解酶突变体制造技术

本发明专利技术涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及一种褐藻胶裂解酶突变体及其应用。所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：4，包含N41S、T90S、G175D和S245T四个突变位点。与野生型相比，所述突变体在里氏木霉中的表达酶活提高了35%，取得了意料不到的技术效果，有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域中的广泛应用。泛应用。

【技术实现步骤摘要】
一种褐藻胶裂解酶突变体


[0001]本专利技术涉及基因工程和蛋白质工程
，具体涉及一种褐藻胶裂解酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]褐藻是我国重要的经济藻类，褐藻胶在海藻工业中产量最大、品种最多、用途最广，被广泛应用于各种工业。褐藻胶的降解产物褐 藻胶寡糖也具有许多生物活性，因此近年来受到许多科研工作者的极大关注。我们通常所指的褐藻胶是褐藻酸的钠盐—褐藻酸钠又名褐藻酸钠，广泛存在于各种褐藻中的一类水溶性酸性多糖物质。褐藻酸钠是由β
‑
D
‑
甘露糖醛酸（M）与α
‑
L
‑
古罗糖醛酸（G）两种基础物构成，通过β
‑
1,4
‑
糖苷键相连接。相对分子质量在33~250 K之间，一般为白 色或淡黄色粉末，无臭无味，不溶于乙醇、乙醚、氯 仿和酸（pH＜5.4），易溶于碱水，吸水膨胀变软， 成黏稠状胶体。 褐藻胶是褐藻细胞壁的重要组分，具有分子质量 大、高聚合度、高黏度及高纤维性等特征，因而人体 吸收利用程度差，很大程度上限制了使用范围。人们通过科学的方法将其分解，变成可吸收利用的有效 成分。褐藻胶的降解产物—褐藻胶寡糖所具有的免疫调节、抑菌、抗病毒能力等生物活性，在医药界具有很大的潜在价值。褐藻胶寡糖属于低分子聚合物，是由2~10个单糖通过糖苷键结合而成的，具有溶解性好，稳定性强，易被机体吸收且安全无毒特点。目前对褐藻胶寡糖进行了深入研究和开发，使其更多的应用到食品、药品、环保、化工等领域，因此具有很高的应用价值。褐藻胶裂解酶作为生产褐藻胶寡糖的工具酶，反应效率高，反应条件温和，可控性强，便于定向制备 褐藻胶寡糖，其研究具有深远理论意义和应用前景。
[0003]褐藻寡糖（AOS）由褐藻胶降解产生，除保留褐 藻胶的优良特性外还具有特殊的化学特性及生物活性，具有更广泛的应用价值。在食品方面作为食品添加剂，农业方面作为植物生长促进剂和治疗剂，医药方面具有抗氧化和抗肿瘤等特性，目前的研究进展，褐藻胶制备褐藻寡糖（AOS）方法分为三种：物理方法，化学方法和生物酶解方法。物理方法主要有辐射降解，热液降解等。降解程度与温度和时间呈正相关。缺点是降解的产物相对分子质量大，较难获得具有生物活性价值的褐藻胶寡糖。化学方法主要有酸水解、碱水解和氧化水解。但是化学方法不 容易控制，耗时长，褐藻胶被降解到一定程度后，副产物多，降解产物浓度低，很难再进一步降解。酶解法具有底物专一、反应条件温和等优点，还可以 定向制备褐藻寡糖，相较于物理、化学法是一种理想且环保的方法。而利用褐藻胶裂解酶，可大大提高低聚糖片段的产率，绿色环保。现如今酶解法将逐渐取代传统的化学降解法。
[0004]褐藻胶裂解酶属于多糖裂解酶（Polysaccharide Lyase，PLs）的一类，褐藻胶裂解酶分布于PL家族 5，6，7，14，15，17，18的7个家族中。褐藻胶裂解酶还可根据酶切位点分为内切酶和外切酶两种，大部 分为内切酶。多数报道发现褐藻胶裂解酶多为poly M 偏好型，少数为poly G偏好型。
[0005]褐藻胶裂解酶通过β
‑
消除机制（β
‑
eliminate），作用于单体间的1
‑
4糖苷键，随着
糖苷键的消除，产物末端六元环C4和C5位会生成不饱和双键，底物 的非还原性末端也会生成不饱和4
‑
deoxy
‑
L
‑
erythrohex
‑4‑
enopyranosyl糖醛酸，从而使得褐藻胶降解成一系列长短不一的寡糖片段。
[0006]迄今为止，许多褐藻胶裂解酶已被鉴定、基因克隆和纯化，其来源多种多样，土壤中分离得到的海洋和陆地细菌、真菌、噬菌体和 病毒（小球藻病毒）等，以褐藻为食的海洋软体动物（鲍鱼Haliotis spp.、海兔Aplysia kurodai、短滨螺 Littorina brevicula等）的肠道中也存在着褐藻胶裂解酶。
[0007]目前对细菌产的褐藻胶裂解酶研究较为广泛和深入，已鉴定出50000多个褐藻胶裂解酶氨基酸序列，其中47000个属于细菌基因组，褐藻胶裂解酶可应用于食品、农业、制药及能源等方面，可以降解褐藻胶，定向制备褐藻寡糖，也可用于阐明褐藻胶的细微结构、制备海藻原生质体、发酵生产乙醇、降解生物膜等。
[0008]褐藻胶裂解酶具有极高的应用价值，能够适用于各个行业。随着基因工程技术的发展，基因工程技术将成为研究褐藻胶裂解酶的关键技术。因此，根据来源不同的褐藻胶，筛选出相应的产酶菌株，建立褐藻胶裂解酶的菌种库；应用研究褐藻胶裂解酶的活性机理，以便利用，可以更好地应用其特点造福人类；在对菌株产酶特异性研究的基础上，应用现代生物技术手段，对菌株的产酶种类、产酶效率进行分子层面的改造，提高其产酶活性和稳定性，以达到酶制剂工业化的需要，构建高效率的工程菌株；应用发酵工程、蛋白质工程、基因工程和酶工程技术，生产工具专用酶，酶解褐藻胶，开发具有特殊功能的褐藻寡糖，为海洋资源的高附加值化的开发，探索新的途径。

技术实现思路

[0009]有鉴于此，本专利技术提供的褐藻胶裂解酶突变体，其酶活水平得到显著提高，有利于降低褐藻胶裂解酶的生产成本。
[0010]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术一方面提供了一种褐藻胶裂解酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
[0011]本专利技术一方面提供了一种褐藻胶裂解酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的褐藻胶裂解酶的第41位氨基酸由Asn变为Ser，第90位氨基酸由Thr变为Ser，第175位氨基酸由Gly变为Asp，第245位氨基酸由Ser变为Thr。
[0012]上述褐藻胶裂解酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：4.上述褐藻胶裂解酶突变体编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。
[0013]本专利技术还提供了携带有上述褐藻胶裂解酶突变体编码基因的重组质粒。
[0014]本专利技术还提供了携带有上述重组质粒的宿主细胞。
[0015]所述宿主细胞为里氏木霉（Trichoderma reesei）。
[0016]与野生型相比，本专利技术提供的包含N41S、T90S、G175D和S245T四个突变位点的褐藻胶裂解酶突变体，其在里氏木霉中的表达酶活得到显著提高。本专利技术构建的重组表达所述褐藻胶裂解酶突变体的里氏木霉工程菌，其摇瓶发酵酶活达到538 U/ml，比重组表达野生型褐藻胶裂解酶的工程菌提高了35%，取得了意料不到的技术效果，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域中的广泛应用。
具体实施方式
[0017]本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECU本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种褐藻胶裂解酶，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。2.一种褐藻胶裂解酶突变体，其特征在于，所述突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的褐藻胶裂解酶的第41位氨基酸由Asn变为Ser，第90位氨基酸由Thr变为Ser，第175位氨基酸由Gly变为Asp，第245位氨基酸由Ser变为Thr。3.如权利要求2所述的褐藻胶裂解酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘士成，张玉忠，鲍锴，陈刚，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：