一种L-苏氨酸醛缩酶突变体、基因及制备L-anti-对甲砜基苯丝氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种L

【技术实现步骤摘要】
一种L
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苏氨酸醛缩酶突变体、基因及制备L
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anti
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对甲砜基苯丝氨酸的方法


[0001]本专利技术涉及酶工程
，特别是涉及一种L
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苏氨酸醛缩酶突变体、基因及制备L
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anti
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对甲砜基苯丝氨酸的方法。

技术介绍

[0002]L
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anti
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对甲砜基苯丝氨酸是一种重要的手性间体，广泛应用于医药、农药、精细化学品的合成。对甲砜基苯丝氨酸有两个手性中心，具有四种异构体，分别是：L
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syn
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对甲砜基苯丝氨酸，L
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anti
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对甲砜基苯丝氨酸，D
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syn
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对甲砜基苯丝氨酸，D
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anti
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对甲砜基苯丝氨酸(图1)。
[0003]目前，没有合成高光学纯度L
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anti
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对甲砜基苯丝氨酸的报道。对甲砜基苯丝氨酸主要有两种生产方法。一种是化学法合成，使用硫酸铜为催化剂，利用金属离子的络合作用，对甲砜基苯甲醛和甘氨酸选择性反应生成两种顺式的产物：L
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syn
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对甲砜基苯丝氨酸铜和D
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syn
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对甲砜基苯丝氨酸铜(图2)，而不能产生L
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anti
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对甲砜基苯丝氨酸。另一种是利用生物法，使用L
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苏氨酸醛缩酶催化对甲砜基苯甲醛和甘氨酸，产物是L
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syn
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对甲砜基苯丝氨酸和L
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anti
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对甲砜基苯丝氨酸的混合物。然后使用化学试剂进行拆分，得到光学纯的L
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syn
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对甲砜基苯丝氨酸。此工艺存在以下缺点：生产工艺复杂，原子利用率不高，理论收率低、同样也会产生严重的环境污染问题。
[0004]相比之下，使用L
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苏氨酸醛缩酶突变体催化对甲砜基苯甲醛和甘氨酸直接生成L
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anti
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对甲砜基苯丝氨酸(图3)，具有以下优点：1、生产工艺简单，反应条件温和；2、L
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苏氨酸醛缩酶的选择性高，产品光学纯度高；3、无需拆分，原子利用率高，理论可达100％；4、生产过程环保，污染较小，符合绿色化学理念；5、下游分离纯化工艺简单。
[0005]利用L
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苏氨酸醛缩酶催化合成L
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anti
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对甲砜基苯丝氨酸的关键在于获得能够高选择性合成L
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anti
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对甲砜基苯丝氨酸的酶。目前报道的L
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苏氨酸醛缩酶对α
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碳具有较高的选择性，ee(％)>99％。而对β
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碳的选择性不高，de(％)在20
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50％之间，产生L
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syn
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对甲砜基苯丝氨酸和L
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anti
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对甲砜基苯丝氨酸的混合物。因此目前没有直接应用L
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苏氨酸醛缩酶合成高手性纯度L
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anti
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对甲砜基苯丝氨酸的研究报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术针对现有L
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anti
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对甲砜基苯丝氨酸合成工艺存在的缺陷，提供了一种利用L
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苏氨酸醛缩酶突变体制备L
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anti
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对甲砜基苯丝氨酸的方法，该方法原料利用率高，且可循环利用。产物易于分离提纯且转化率、收率及手性纯度高；与化学催化工艺相比，工艺简单，污染小。
[0007]具体技术方案如下：
[0008]一种L
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苏氨酸醛缩酶突变体，由登录号为WP_069998496.1的野生型L
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苏氨酸醛缩酶突变所得，具体为以下突变中的一种：H305Y/Y8I、H305Y/Y8I/W307H、H305Y/Y8I/W307S，
H305Y/Y8I/W307E，H305Y/Y8I/Y31N/W307E，H305Y/Y8L/Y31N/W307E，H305Y/Y8V/Y31G/W307E和H305Y/Y8Q/Y31N/W307E。
[0009]本专利技术又提供了编码所述L
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苏氨酸醛缩酶突变体的基因。
[0010]本专利技术又提供了包含所述基因的表达载体。优选的，所述的表达载体为插入有所述基因的pET28a质粒。
[0011]本专利技术又提供了包含所述基因的基因工程菌。
[0012]本专利技术又提供了所述L
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苏氨酸醛缩酶突变体、所述基因或所述基因工程菌中的一种在制备L
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anti
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对甲砜基苯丝氨酸中的应用。
[0013]本专利技术还提供了一种制备L
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anti
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对甲砜基苯丝氨酸的方法，以甘氨酸和对甲砜基苯甲醛为底物，以磷酸吡哆醛为辅酶，利用所述L
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苏氨酸醛缩酶突变体或表达所述L
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苏氨酸醛缩酶突变体的细胞作为催化剂，缩合反应生成L
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anti
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对甲砜基苯丝氨酸。表达所述L
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苏氨酸醛缩酶突变体的细胞可以是上述包含所述基因的基因工程菌。
[0014]优选的，反应在有机溶剂
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水混合溶液或水溶液中进行。更优选的，有机溶剂为DMF或DMSO，有机溶剂的添加量为总体积的≤20％。该反应能够在水相中反应，但添加了一些有机溶剂后，能够在一定程度上提高反应的转化率以及de值。
[0015]反应体系中，催化剂的使用形式为细胞破碎后的粗酶液，也可以为表达重组酶的工程菌静息细胞，还可以采用纯化后的纯酶，或者是经固定化后的酶。
[0016]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0017]1、生产工艺简单，反应条件温和；
[0018]2、L
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苏氨酸醛缩酶的选择性高，产品光学纯度高，无需拆分；
[0019]3、原子利用率高，理论可达100％；
[0020]4、生产过程环保，污染较小，符合绿色化学理念；
[0021]5、产品分离纯化简单。
附图说明
[0022]图1为对甲砜基苯丝氨酸四种构型分子结构示意图。
[0023]图2为化学合成法合成对甲砜基苯丝氨酸的方程式。
[0024]图3为生物合成法合成L
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anti
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对甲砜基苯丝氨酸的方程式。
具体实施方式
[0025]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种L
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苏氨酸醛缩酶突变体，其特征在于，由登录号为WP_069998496.1的野生型L
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苏氨酸醛缩酶突变所得，具体为以下突变中的一种：H305Y/Y8I、H305Y/Y8I/W307H、H305Y/Y8I/W307S，H305Y/Y8I/W307E，H305Y/Y8I/Y31N/W307E，H305Y/Y8L/Y31N/W307E，H305Y/Y8V/Y31G/W307E和H305Y/Y8Q/Y31N/W307E。2.编码如权利要求1所述L
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苏氨酸醛缩酶突变体的基因。3.包含如权利要求2所述基因的表达载体。4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，为插入有如权利要求2所述基因的pET28a质粒。5.包含如权利要求2所述基因的基因工程菌。6.如权利要求1所述L
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苏氨酸醛缩酶突变体、如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴坚平，肖岚馨，郑文隆，方赛，徐刚，杨立荣，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：