一种改进的ccdB蛋白编码基因及其相关生物材料和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种改进的ccdB蛋白编码基因及其相关生物材料和应用，属于基因工程技术领域。所述改进的ccdB蛋白编码基因具有SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.7任一所示的核苷酸序列。本发明专利技术还公开了与所述改进的ccdB蛋白编码基因相关的生物材料。利用本发明专利技术所述的改进的ccdB蛋白编码基因或其相关生物材料制备单克隆抗体相关蛋白，能够大大提升转化效率，适用于高通量单克隆抗体的开发和生产，具有非常好的应用价值。用价值。用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种改进的ccdB蛋白编码基因及其相关生物材料和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体地，涉及一种改进的ccdB蛋白编码基因及其相关生物材料和应用。

技术介绍

[0002]经过多年的发展，单克隆抗体已经走出实验室延伸到临床诊断和治疗性单克隆抗体药物，在基础科研和生命科学各领域中发挥着越来越重要的作用。B细胞克隆技术是近年来新发展的一种速制备单克隆抗体的技术，是根据单个B细胞只产生一种特异性抗体的特性，通过分子克隆技术从单个抗体分泌B细胞中扩增IgG重链(Heavy chain)和轻链(Light chain)的全长(Full length)或可变区(Variable region)基因并构建到载体(vector)上，然后在哺乳动物细胞内表达获得具有生物活性的单克隆抗体。这种方法既保留了重链和轻链的天然配对，又具有基因多样性好、效率高、全天然源性的特点，也成为了目前快速开发诊断抗体原料和治疗性抗体药物前体的重要策略。但高通量抗体基因的重组成功率仍然是现在B细胞克隆技术所面临的难题之一，即在通过PCR获得大量抗体基因后，如何快速高效地实现大规模重组载体构建的问题。
[0003]B细胞克隆技术的其中一个过程是将抗体的重链和轻链基因克隆到表达载体上，以获得大量的重组质粒转染哺乳动物细胞，如HEK293细胞、CHO细胞等，表达产生基因工程抗体。传统分子克隆方法采用(双)酶切
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去磷酸化的方法制备载体，并通过胶回收方法或磁珠法进行载体纯化。但一直存在酶切不完全、去磷酸化不彻底的问题，这一问题会导致载体自连产生空载体从而影响高通量重组成功率。为了解决这一问题，可引入ccdB等自杀基因，使含自连空载体的宿主菌无法存活，从而提供重组阳性率。
[0004]自杀基因ccdB编码一个含101个氨基酸的毒素蛋白ccdB。细胞内和细胞外试验证明，ccdB能与解旋酶
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DNA复合体结合并阻止DNA缺口的重新缝合，导致双链DNA损伤，阻止DNA和RNA聚合酶的通过，影响DNA复制和转录，从而导致细胞死亡。由于ccdB的这种强毒性效应，ccdB可以被构建到表达载体上然后再转化到大肠杆菌感受态细胞中。ccdB的表达产物能抑制普通大肠杆菌生长，所以只有那些成功克隆进外源基因的大肠杆菌才能正常生长，而克隆时没有被切开或自身环化的载体因为仍然含有ccdB基因，所以其转化的大肠杆菌在转化后则不能生长。这样生长起来的克隆为含有外源基因的所需克隆。
[0005]在载体中引入ccdB等自杀基因是分子克隆技术的一大进步，与不含自杀基因的载体相比可显著降低自连空载体比例，可使重组成功率达到90％以上，但仍无法彻底消除空载体。这在大规模、高通量的载体构建中仍然会产生少部分的假阳性，给下游的表达带来不确定性，所以天然ccdB基因的引物仍无法满足高通量重组抗体构建的需求。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：
[0007]本专利技术第一方面提供一种改进的ccdB蛋白编码基因，所述改进的ccdB蛋白编码基
因具有SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.7任一所示的核苷酸序列。
[0008]在本专利技术的中，所述改进的ccdB蛋白编码基因是通过对ccdB蛋白进行密码子优化得到的。密码子在生物体遗传信息的mRNA到蛋白质的传递过程中起着关键作用，编码20种不同氨基酸的密码子共61种，其中只有Met和Trp两种氨基酸由一种密码子编码，其他18种氨基酸均由2种或2种以上的密码子编码，称为同义密码子(synonymous codon)。在蛋白质的合成过程中，同义密码子的使用概率并不相同。某一物种或某一基因通常倾向于使用一种或几种特定的同义密码子，这些密码子被称为最优密码子(Optimal Codon)，此现象被称为密码子偏爱性(Codon Usage bias)。
[0009]在本专利技术中，根据大肠杆菌密码子偏好性，从密码子适应指数(CAI)、稀有密码子和GC含量三个方面对ccdB基因进行密码子优化，得到了具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的改进的ccdB蛋白编码基因。
[0010]密码子适应指数(CAI)是指编码区同义密码子与最佳密码子使用频率的相符程度，取值在0～1之间。CAI可以用来评估外源基因在宿主内的表达水平，CAI越高，则外源基因在宿主内的表达水平越高2。绝大多数生物体在合成蛋白质时使用密码子具有一定的偏好性，被最频繁利用的称为佳密码子，那些不被经常利用的称为稀有密码子。基因序列中GC含量会对DNA的稳定性、mRNA的二级结构等造成影响，间接影响基因的表达调控。当基因序列中稀有密码子和GC含量越高，其蛋白表达的效率越低。所以，通过优化稀有密码子和GC含量可有效提高基因在宿主细胞内的表达效率。
[0011]进一步地，专利技术人意外地发现，当P28的密码子为CCT或CCA、W100的密码子为GGT或GGA时ccdB基因的表达量最高，自杀效果最好，由此获得了具有SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的改进的ccdB蛋白编码基因。
[0012]本专利技术第二方面提供与本专利技术第一方面所述的改进的ccdB蛋白编码基因相关的生物材料，为下述B1)至B7)中的任一种：
[0013]B1)含有权利要求1所述的改进的ccdB蛋白编码基因的表达盒；
[0014]B2)含有权利要求1所述的改进的ccdB蛋白编码基因的重组载体；
[0015]B3)含有B1)所述表达盒的重组载体；
[0016]B4)含有权利要求1所述的改进的ccdB蛋白编码基因的重组微生物；
[0017]B5)含有B1)所述表达盒的重组微生物；
[0018]B6)含有B2)所述重组载体的重组微生物；
[0019]B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物。
[0020]在本专利技术中，所述表达盒是指包括启动子、目标基因和终止子的DNA分子。
[0021]在本专利技术的一些实施方案中，所述载体选自包括pcDNA载体、pTT5载体、pCMV载体、pCEP载体、pBV载体和pSV2载体的组中的一种。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述载体为pBV载体。
[0022]在本专利技术的一些实施例中，所述重组微生物为细菌。进一步地，所述细菌为大肠杆菌，更进一步地，所述大肠杆菌选自包括DH5α、Top10和JM109的组中的一种。在本专利技术的一些优选实施方案中，所述大肠杆菌为DH5α。
[0023]本专利技术第三方面提供本专利技术第一方面所述的改进的ccdB蛋白编码基因或本专利技术第二方面所述生物材料在制备目标蛋白中的应用。
[0024]本专利技术第四方面提供一种制备目标蛋白的方法，包括：
[0025]S1，获得含有本专利技术第一方面所述的改进的ccdB蛋白编码基因的重组载体，在所述改进的ccdB蛋白编码基因两端分别设置第一酶切位点和第二酶切位点；
[0026]S2，将所述目标蛋白的编码基因两本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种改进的ccdB蛋白编码基因，其特征在于，所述改进的ccdB蛋白编码基因具有SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.7任一所示的核苷酸序列。2.与权利要求1所述的改进的ccdB蛋白编码基因相关的生物材料，为下述B1)至B7)中的任一种：B1)含有权利要求1所述的改进的ccdB蛋白编码基因的表达盒；B2)含有权利要求1所述的改进的ccdB蛋白编码基因的重组载体；B3)含有B1)所述表达盒的重组载体；B4)含有权利要求1所述的改进的ccdB蛋白编码基因的重组微生物；B5)含有B1)所述表达盒的重组微生物；B6)含有B2)所述重组载体的重组微生物；B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物。3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述载体选自包括pcDNA载体、pTT5载体、pCMV载体、pCEP载体、pBV载体和pSV2载体的组中的一种。4.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述重组微生物为细菌。5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述细菌为大肠杆菌，进一步地，所述大肠杆菌选自包括DH5α、Top10和JM109的组中的一种。6.权利要求1所述的改进的ccdB蛋白编码基因或权利要求2所述的生物材料在制备目标蛋白中的应用。7.一种制备目标蛋白的方法，其特征在于，包括：S1，获得含有权利要求1所述的改进的ccd...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明振，蔡宁，
申请(专利权)人：杭州百凌生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：