【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于抗体还原，具体地，涉及一种还原抗体铰链区的试剂盒、方法和应用。
技术介绍
1、抗体中可用于偶联的天然氨基酸主要有赖氨酸和半胱氨酸，一个抗体分子包含了80-90个赖氨酸，偶联可能会发生在将近40个不同的赖氨酸残基上，会造成偶联产物的高度异质，一般不作为第一选择。半胱氨酸残基可以通过还原抗体的二硫键得到，但抗体内源二硫键的还原也是非特异性的，铰链区二硫键及轻重链间的二硫键均可被还原剂还原，会造成偶联产物成分多样，尤其是轻重链间二硫键的还原会影响抗体的抗原结合位点，因此需要化学控制二硫键的还原，使抗体二硫键的还原主要发生在铰链区。目前常采用的二硫键还原剂是2-mea和tcep，由于2-mea本身含有巯基，会影响后续偶联。tcep还原二硫键的反应条件已经较成熟，但只还原抗体铰链区的反应条件探索的还较少。
2、采用抗体的半胱氨酸进行偶联时，需要控制二硫键的还原位置，使其尽量发生在抗体铰链区，一般均是采用水用于母液的配制，加入母液时，较窄的工作浓度对配制要求较高，在进行工艺放大时，配制浓度过低会使抗体铰链区二硫键还原不完全，配制浓度过高会对抗体轻重链间的二硫键进行还原，最终会影响抗体对抗原的特异性亲和。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：
2、本专利技术第一方面提供一种缓冲液和碱性试剂在制备基于磷酸三氯乙酯还原抗体铰链区的试剂盒中的应用，所述缓冲液的浓度为0.08～0.15m，还包括0.1～0.2m的无机盐和8～15mm
3、(1)调整所述缓冲液的ph值；
4、(2)调整所述抗体溶液的ph值；
5、(3)调整所述磷酸三氯乙酯溶液的ph值，和/或
6、(4)调整所述混合液的ph值，
7、使得所述混合液的ph值为6.7～7.3。
8、在本专利技术的一些实施方案中，所述缓冲液选自包括pbs、tris-hcl、mops和mes的组中的一种。
9、在本专利技术的一些实施方案中，所述无机盐选自包括氯化钠、氯化钾、碳酸钾、碳酸钠、硫酸钾和硫酸钠组中的至少一种
10、在本专利技术的一些实施方案中，所述螯合剂选自包括乙二胺四乙酸edta、柠檬酸、乙二醇二乙醚二胺四乙酸egta、次氮基三乙酸三钠盐一水合物nta的组中的至少一种。
11、本专利技术第二方面提供一种基于磷酸三氯乙酯还原抗体铰链区的试剂盒，包括缓冲液和碱性试剂，所述缓冲液的浓度为0.08～0.15m，还包括0.1～0.2m的盐离子和8～15mm的螯合剂。
12、本专利技术第三方面提供一种利用本专利技术第二方面所述的试剂盒还原抗体铰链区的方法，包括以下步骤：
13、s1，利用所述缓冲液分别溶解抗体和磷酸三氯乙酯，分别得到抗体溶液和磷酸三氯乙酯溶液，将所述抗体溶液和所述磷酸三氯乙酯溶液按一定比例混合得到混合液，所述一定比例使得所述混合液中的磷酸三氯乙酯浓度为3mm～200mm；
14、s2，将所述混合液置于室温条件下，15～30rpm/min，避光反应15～30min，
15、其中，利用所述碱性试剂调整所述缓冲液、所述抗体溶液、所述磷酸三氯乙酯溶液和/或所述混合液的ph值，使得在步骤s2之前，所述混合液的ph值为6.7～7.3。
16、在本专利技术中，关于ph值的调整可以放在任意步骤，例如对所述缓冲液进行单独调整，或者对所述抗体溶液进行单独调整，或者对磷酸三氯乙酯溶液进行单独调整，只要使得最终的混合液的ph值为6.7～7.3即可。当然，也可以对所述缓冲液、所述抗体溶液、所述磷酸三氯乙酯溶液和所述混合液中的2种、3种甚至4种均进行调整，合理在反应前混合液的ph值为6.7～7.3。还可以仅对混合液进行调整。
17、在本专利技术的一些具体实施方案中，在步骤s1之前，利用所述碱性试剂调整所述缓冲液的ph值，使得步骤s1中得到的所述混合液的ph值为6.7～7.3。
18、在本专利技术的一些具体实施方案中，抗体溶液经过或未经过所述碱性试剂调整具有第一ph值；所述磷酸三氯乙酯溶液经过或未经过所述碱性试剂调整具有第二ph值，所述第一ph值和所述第二ph值使得所述混合液的ph值为6.7～7.3。
19、在本专利技术的一些具体实施方案中，在步骤s2之前，利用所述碱性试剂调整所述混合液的ph值，使得所述混合液的ph值为6.7～7.3。
20、本专利技术第四方面提供一种用于还原抗体铰链区的反应液，包括本专利技术第一方面所述的缓冲液，所述缓冲液中还包括3mm～200mm的磷酸三氯乙酯，所述反应液的ph值为6.7～7.3。
21、在本专利技术的一些实施方案中，还包括5～20mg/ml的抗体。
22、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述抗体为单克隆抗体和/或多克隆抗体。
23、本专利技术的有益效果
24、相对于现有技术，本专利技术具有以下技术效果：
25、本专利技术意外地发现，单独调整溶解磷酸三氯乙酯的溶剂类型或ph值，对抗体铰链区的还原效果均不符合要求，而当利用本第专利技术的缓冲液作为溶剂，并对ph值进行调整后，磷酸三氯乙酯工作浓度在3.8～200mm范围内均可对抗体的铰链区进行稳定还原。
26、利用本专利技术，通过调整用于溶解磷酸三氯乙酯的溶剂类型及ph值，使得磷酸三氯乙酯在较宽的工作浓度范围内均只对抗体的铰链区进行还原，使抗体的铰链区还原稳定，降低试剂配制的难度和操作的复杂性。
27、利用本专利技术，可能对多种类型或多种来源的抗体进行铰链区还原，具有广泛的应用前景。
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1.一种缓冲液和碱性试剂在制备基于磷酸三氯乙酯还原抗体铰链区的试剂盒中的应用，其特征在于，所述缓冲液的浓度为0.08～0.15M，还包括0.1～0.2M的无机盐和8～15mM的螯合剂，所述缓冲液用于溶解所述抗体和所述磷酸三氯乙酯以分别得到抗体溶液和磷酸三氯乙酯溶液并且混合得到混合液，所述碱性试剂用于：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缓冲液选自包括PBS、Tris-HCl、TAPS、HEPES、MOPS和MES的组中的一种。
3.一种基于磷酸三氯乙酯还原抗体铰链区的试剂盒，其特征在于，包括缓冲液和碱性试剂，所述缓冲液的浓度为0.08～0.15M，还包括0.1～0.2M的无机盐和8～15mM的螯合剂。
4.一种利用权利要求3所述的试剂盒还原抗体铰链区的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤S1之前，利用所述碱性试剂调整所述缓冲液的pH值，使得步骤S1中得到的所述混合液的pH值为6.7～7.3。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，抗体溶液经过或未经过所述碱性试
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤S2之前，利用所述碱性试剂调整所述混合液的pH值，使得所述混合液的pH值为6.7～7.3。
8.一种用于还原抗体铰链区的反应液，其特征在于，包括权利要求2所述的缓冲液，所述缓冲液中还包括3mM～200mM的磷酸三氯乙酯，所述反应液的pH值为6.7～7.3。
9.根据权利要求7所述的反应液，其特征在于，还包括5～20mg/mL的抗体。
10.根据权利要求9所述的反应液，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体和/或多克隆抗体。
...【技术特征摘要】
1.一种缓冲液和碱性试剂在制备基于磷酸三氯乙酯还原抗体铰链区的试剂盒中的应用，其特征在于，所述缓冲液的浓度为0.08～0.15m，还包括0.1～0.2m的无机盐和8～15mm的螯合剂，所述缓冲液用于溶解所述抗体和所述磷酸三氯乙酯以分别得到抗体溶液和磷酸三氯乙酯溶液并且混合得到混合液，所述碱性试剂用于：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缓冲液选自包括pbs、tris-hcl、taps、hepes、mops和mes的组中的一种。
3.一种基于磷酸三氯乙酯还原抗体铰链区的试剂盒，其特征在于，包括缓冲液和碱性试剂，所述缓冲液的浓度为0.08～0.15m，还包括0.1～0.2m的无机盐和8～15mm的螯合剂。
4.一种利用权利要求3所述的试剂盒还原抗体铰链区的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤s1之前，利用所述碱性试剂调整所...
【专利技术属性】
技术研发人员：张玲，李明振，蔡宁，
申请(专利权)人：杭州百凌生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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