一种四型胶原蛋白制造技术

本发明专利技术公开了一种检测四型胶原蛋白α5的抗体、检测试剂盒及其应用，属于免疫检测技术领域。其中，所述检测四型胶原蛋白α5的抗体为COL4A5单抗，所述COL4A5单抗能够特异性识别四型胶原蛋白α5如SEQ ID NO:19所示的蛋白片段。本发明专利技术还公开了包括所述COL4A5单抗的抗体组合。本发明专利技术还公开了所述COL4A5单抗或抗体组合在制备四型胶原蛋白检测试剂盒中的应用及其制备得到的试剂盒。利用本发明专利技术的试剂盒检测Alport综合征，特异性高，灵敏性强，具有非常大的临床应用价值。的临床应用价值。的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种四型胶原蛋白
ɑ
5的抗体、检测试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于免疫检测
，具体地，涉及一种四型胶原蛋白
ɑ
5的抗体、检测试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]遗传性肾炎，即阿尔波特综合征(Alport综合征，AS)是一种主要表现为血尿、肾功能进行性减退、感音神经性耳聋和眼部异常的遗传性肾小球基底膜疾病，是由于编码肾小球基底膜的主要胶原成分
‑
IV胶原基因突变而产生的疾病。基因突变的发生率约为1/10000～1/5000。根据遗传方式可分为：
①
X连锁显性遗传(X
‑
linked dominant，XL，约占80％)，致病基因在X染色体上，遗传与性别有关。
②
常染色体隐性遗传(autosomal recessive，AR；约占15％)，致病基因在常染色体上。
③
常染色体显性遗传(autosomal dominant，AD；极少数)。三种遗传方式分别因编码IV型胶原不同
ɑ
链的基因COL4A5、COL4A6、COL4A3和/或COL4A4突变所致。
[0003]遗传性肾炎的发病原因为：IV型胶原6条
ɑ
链聚合成3条三股螺旋分子结构称为单体，单体聚合形成二聚体或四聚体，再相互绞连形成胶原网状结构。X连锁显性遗传Alport综合征得基因突变主要发生在编码IV型胶原
ɑ
5链的基因(COL4A5)。常染色体隐性遗传Alport综合征的基因突变则发生在2号染色体上编码IV型胶原
ɑ
3链或者
ɑ
4链的基因(COL4A3/COL4A4)上，而IV型胶原
ɑ
1链或IV型胶原
ɑ
2链的基因还是正常表达，即不管是遗传性肾小球肾炎还是正常肾小球，IV型胶原
ɑ
1链或IV型胶原
ɑ
2链都会正常表达。
[0004]目前对于遗传性肾炎的检测方法有：1、光镜检测。遗传性肾炎病理改变不具特征性，在电镜技术应用前，曾认为Alport综合征属于慢性间质性肾炎，并误将肾间质泡沫细胞作为诊断依据。(2)应用特异性的抗IV型胶原不同
ɑ
链的抗体在肾脏以及皮肤组织进行免疫荧光检测，可以诊断X连锁显性遗传型男性、女性以及常染色体隐性遗传型Alport综合征。(3)电镜观察：电镜下可观察到Alport综合征特征性的病理改变，GBM广泛增厚、或变薄以及致密层分裂为其典型病变。
[0005]目前现有技术中有2类试剂盒用于遗传性肾炎的鉴别诊断：一类是瑞典公司的wieslab Alprot
’
s syndrome kit。其试剂盒组成包含抗小鼠COL4A1、COL4A3的单克隆抗体及其对应的FITC偶联的小鼠二抗；抗大鼠COL4A5的单克隆抗体及其对应的FITC偶联的大鼠二抗，该体系适用于免疫荧光细胞化学染色。另外该试剂盒还可用于石蜡包埋的组织，用于免疫组织化学染色，但是该方法需要分别对三个四型胶原蛋白抗体进行单独的IHC染色，方法比较复杂。另一类是日本COSMO公司的荧光免疫化学染色试剂盒，该方法使用COL4A2和COL4A5分别标记红色荧光和绿色荧光，再按照一定的配比作为一抗与肾组织上的抗原进行结合反应。使用荧光显微镜进行结果观察。理论上COL4A2在肾小球及肾小管上均有基底膜的定位，COL4A5的表达谱比较窄，正常情况下一般只定位在肾小球上，肾小管基本不染色。若病理存在遗传性肾炎(即Alport综合征)，那么COL4A5在肾小球上缺失表达。
[0006]目前，现有技术中缺少COL4A3和COL4A5重组兔单克隆抗体，同时应用于Alport综
合征的COL4A1重组兔单克隆抗体也明显不足。

技术实现思路

[0007]为了解决上述技术问题中的至少一个，本专利技术旨在提供3个四型胶原蛋白即四型胶原蛋白α1(COL4A1)、四型胶原蛋白α3(COL4A3)、四型胶原蛋白α5(COL4A5)单克隆抗体及其可变区序列，并由此组成病理诊断试剂盒，及其在Alport综合征辅助诊断中的应用。为了达到该目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0008]本专利技术第一方面提供一种COL4A1单抗，所述COL4A1单抗的重链可变区如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区如SEQ ID NO:2所示；所述COL4A1单抗的重链可变区CDR
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H1、CDR
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H2、CDR
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H3和轻链可变区CDR
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L1、CDR
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L2、CDR
‑
L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3～8所示。
[0009]本专利技术第二方面提供一种COL4A3单抗，所述COL4A3单抗能够特异性识别四型胶原蛋白α3如SEQ ID NO:9所示的蛋白片段。在本专利技术的一些实施方案中，所述COL4A3单抗利用氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的人COL4A3蛋白多肽片段交联KLH后免疫兔得到。
[0010]在本专利技术的一些实施方案中，所述COL4A3单抗的重链可变区如SEQ ID NO:11所示，轻链可变区如SEQ ID NO:12所示；所述COL4A3单抗的重链可变区CDR
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H1、CDR
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H2、CDR
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H3和轻链可变区CDR
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L1、CDR
‑
L2、CDR
‑
L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:13～18所示。
[0011]本专利技术第三方面提供一种COL4A5单抗，所述COL4A5单抗能够特异性识别四型胶原蛋白α5如SEQ ID NO:19所示的蛋白片段。在本专利技术的一些实施方案中，所述COL4A5单抗利用氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示的人COL4A5蛋白多肽片段经修饰并交联KLH后免疫兔得到，优选地，所述修饰是指在多肽氨基酸序列氨基端添加一个半胱氨酸，以便于进行交联反应。
[0012]在本专利技术的一些实施方案中，所述COL4A4单抗的重链可变区如SEQ ID NO:21所示，轻链可变区如SEQ ID NO:22所示；所述COL4A5单抗的重链可变区CDR
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H1、CDR
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H2、CDR
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H3和轻链可变区CDR
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L1、CDR
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L2、CDR
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L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:23～28所示。
[0013]本专利技术第四方面提供一种检测四型胶原蛋白的抗体组合，所述抗体组合包括本专利技术第一方面所述的COL4A1单抗，还包括本专利技术第二方面所述的COL4A3单抗和/或本专利技术第三方面所述的COL4A5单抗。
[0014]在本专利技术的一些实施方案中，所述抗体组合包括本专利技术第一方面所述的COL4A1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种COL4A5单抗，其特征在于，所述COL4A5单抗能够特异性识别四型胶原蛋白α5如SEQ ID NO:19所示的蛋白片段，所述COL4A5单抗的重链可变区CDR
‑
H1、CDR
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H2、CDR
‑
H3和轻链可变区CDR
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L1、CDR
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L2、CDR
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L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:23～28所示。2.一种检测四型胶原蛋白的抗体组合，其特征在于，所述抗体组合包括COL4A1抗体，还包括权利要求1所述的COL4A5单抗。3.根据权利要求2所述的抗体组合，其特征在于，所述COL4A1为单抗，且单抗的重链可变区CDR
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H1、CDR
‑
H2、CDR
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H3和轻链可变区CDR
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L1、CDR
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L2、CDR
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L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明振，潘丽，吴佳，蔡宁，
申请(专利权)人：杭州百凌生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：