重组SLO抗原的制备方法和应用技术

本申请公开了一种重组SLO抗原的制备方法和应用。本申请中，开发了基于基因工程技术的SLO抗原制备方法，将经同义密码子偏好性优化的编码SLO抗原的多核苷酸导入载体，成功构建原核表达质粒，提高了目的蛋白的表达量；并经过培养基和培养温度等培养条件的优化，实现了高比例可溶性蛋白的表达，所得抗原活性高。所得抗原活性高。所得抗原活性高。

【技术实现步骤摘要】
重组SLO抗原的制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，特别涉及重组SLO抗原的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]链球菌溶血素O(Streptolysin
‑
O或简称SLO)是A族链球菌毒素的分泌毒力因子，属于硫醇活化毒素组。其分子量为63.64kDA，是由571个氨基酸组成。一般来说，A族链球菌感染患者在感染后2周左右即可检出SLO抗体。并且随着感染时间加长，SLO抗体含量逐渐升高，于感染后第4周到达顶峰。其中以活动性风湿热和急性肾小球肾炎为例，感染后SLO抗体有明显升高，其效价能达到1：400。因此SLO抗体的含量逐渐升高对于临床诊断有重要意义。从天然的溶血链球菌菌株中提取SLO蛋白存在产量低、操作风险大、不易于工业化生产等缺点。应用重组蛋白法制备SLO抗原虽然解决了天然纯化中来源短缺的问题，但所得产物产量低、稳定性不好、活性低。
[0003]因此，本领域尚需开发产量高、稳定性好，活性高的重组SLO抗原的制备方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种重组SLO抗原制备方法。
[0005]本专利技术的另一目的在于提供一种编码SLO抗原的多核苷酸序列。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供与编码SLO抗原的多核苷酸序列适配的载体。
[0007]本专利技术的另一目的在于提供含有编码SLO抗原的多核苷酸序列的试剂盒。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术第一方面，提供了一种编码SLO抗原的多核苷酸，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：
[0009](i)具有如SEQ ID NO.2所示序列的多核苷酸；
[0010](ii)具有与如SEQ ID NO.2所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和
[0011](iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。
[0012]本专利技术第二方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包括本专利技术第一方面提供的多核苷酸。
[0013]在一些优选的方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，更优选为pET
‑
28a(+)。
[0014]本专利技术第三方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本专利技术第二方面提供的表达载体；或者
[0015]所述宿主细胞的基因组中整合有如本专利技术第一方面提供的多核苷酸。
[0016]在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)。
[0017]在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株。
[0018]本专利技术第四方面提供了一种制备SLO抗原的方法，所述方法包括步骤：培养本专利技术第三方面所述的宿主细胞，以表达出目的蛋白；和
[0019]分离所述目的蛋白，即得所述SLO抗原；
[0020]其中，所述目的蛋白具有如氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
[0021]在一些优选的方案中，所述宿主细胞通过含有本专利技术第一方面所述多核苷酸的质粒转化大肠杆菌获得。
[0022]在一些优选的方案中，用SB、TB或SOC培养基培养所述的宿主细胞。为获得大量可溶性表达，在更优选的方案中，用TB培养基培养所述的宿主细胞。
[0023]在一些优选的方案中，在振荡的环境中培养所述的宿主细胞。
[0024]在一些优选的方案中，在温度为16至19℃下培养所述宿主细胞；或在温度为36至38℃下培养所述宿主细胞。
[0025]在一些更优选的方案中，在温度为16至19℃下，用TB培养基培养所述宿主细胞，可获得更高的可溶性目的蛋白表达。
[0026]在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。
[0027]在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，使用IPTG进行诱导，以表达出目的蛋白。
[0028]在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，培养至OD600在0.6至0.8，后使用IPTG进行诱导，以表达出目的蛋白。
[0029]在一些优选的方案中，所述分离所述目的蛋白的步骤包括：
[0030]将经破碎的目的蛋白上清液通过层析柱，进行洗脱，收集洗脱液。
[0031]在一些优选的方案中，所述层析柱为Ni
‑
柱亲和层析柱。
[0032]本专利技术第五方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：如本专利技术第一方面提供的的多核苷酸；或者
[0033]如本专利技术第二方面提供的表达载体；或者
[0034]如本专利技术第三方面所述的宿主细胞；或者
[0035]或者根据本专利技术第四方面所述的方法制备的SLO抗原。
[0036]本专利技术相对于现有技术而言，至少具有下述优点：
[0037](1)本专利技术开发了基于基因工程技术的SLO抗原制备方法，将经同义密码子偏好性优化的编码SLO抗原的多核苷酸导入载体，成功构建原核表达质粒，提高了目的蛋白的表达量；
[0038](2)本专利技术开发了基于基因工程技术的SLO抗原制备方法，经过培养基和培养温度等培养条件的优化，实现了高比例可溶性蛋白的表达，所得抗原活性高；
[0039](4)本专利技术优选的实施方式中提供的SLO抗原制备方法制备的SLO抗原，在化学发光检测中能获得大于R值大于0.99的标准曲线，线性良好。
[0040]应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0041]一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
[0042]图1是根据本专利技术实施例中制备的SLO抗原的SDS
‑
PAGE鉴定结果图；
[0043]图2是根据本专利技术实施例中18℃诱导表达SLO抗原电泳图。
[0044]图3是根据本专利技术实施例中25℃诱导表达SLO抗原电泳图。
具体实施方式
[0045]本专利技术人经过广泛而深入的研究，开发了基于原核表达系统的SLO抗原表达体系，并进一步通过同义密码子偏好性优化，得到了能够在大肠杆菌表达系统中大量表达目的蛋白的编码SLO抗原的多核苷酸序列，所表达的目的蛋白活性高，稳定性好。
[0046]专利技术人进一步通过对SLO抗原表达条件的优化，包括培养基和培养温度的优化，获得了高效可溶性表达SLO抗原的方法。在本专利技术的更优选的实施方式中，在18℃的温度下，用TB培养基培养包含本专利技术编码SLO抗原的多核苷酸的宿主细胞。
[0047]获取目的基因/获取目的蛋白有关的核酸序列
[0048]本专利技术中目的蛋白或其元件的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种编码SLO抗原的分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：(i)具有如SEQ ID NO.2所示序列的多核苷酸；(ii)具有与如SEQ ID NO.2所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和(iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。2.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求1所述的多核苷酸。3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，优选为pET
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28a(+)。4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求2或3中任一项所述的表达载体；或者所述宿主细胞的基因组中整合有如权利要求1所述的多核苷酸。5.一种制备SLO抗原的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：使含有如权利要求1所述的多核苷酸载体转化...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋析文，黄黉，肖兰花，汪育泰，况修丽，
申请(专利权)人：广州达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：