一种提高伊短菌素合成的短短芽孢杆菌工程菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及过表达edeB提高伊短菌素（edeines）合成的短短芽孢杆菌工程菌株及其构建方法与应用。本发明专利技术通过挖掘发现短短芽孢杆菌的转录因子edeB基因，其在edeines生物合成过程中起着正调控作用。过表达edeB基因可显著增加短短芽孢杆菌X23中edeines的产量。与野生型X23相比，edeB基因过表达可使edeines总产量增加92.27%。表达可使edeines总产量增加92.27%。

【技术实现步骤摘要】
al. Simple and rapid direct cloning and heterologous expression of natural product biosynthetic gene cluster in Bacillus subtilis via Red/ET recombineering[J]. Scientific reports, 2016, 6: 34623.）。
[0004]尽管随着基因组测序的展开，在许多芽孢杆菌中发现了ParB家族同源蛋白，但它们的功能并不清楚。有必要在此基础上，继续研究edeines生物合成过程中调控蛋白的具体功能，揭示调控基因对edeines产量的影响机制。预期对edeines生物合成调控机制的研究，将深化对edeines生物合成的理解，为通过基因功能进行定向遗传改良构建edeines高产菌株提供理论依据。

技术实现思路

[0005]本专利技术通过对edeines生物合成基因簇的生物信息学分析，发现了1个可能转录调控基因edeB。EdeB蛋白序列中包含典型的螺旋
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转角
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螺旋（HTH， helix
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turn
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helix），属于ParB蛋白家族。本专利技术利用Red/ET同源重组技术，敲除edeB基因获得缺失突变株X23(ΔedeB)，利用表达质粒PAD
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Apr
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Px
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edeB载体构建回补菌株X23(ΔedeB) (PAD
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Apr
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Px
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edeB)和过表达菌株X23 (PAD
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Apr
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Px
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edeB)，通过对edeB基因缺失突变株、回补菌株、过表达菌株和野生型菌株X23发酵产量的对比分析，考察了edeB对edeines产量的影响，通过EMSA实验确认了EdeB蛋白与edeines基因簇启动子的结合能力，为edeines生物合成调控机制研究奠定了基础，并为后续提高edeines产量提供了参考。由此完成了本专利技术。
[0006]本专利技术首先提供一种转录因子edeB基因，所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者来自于短短芽孢杆菌且具有与其至少95%以上，优98%以上，更优选99%以上的同一性，仍具所述功能的基因。
[0007]进一步提供含有所述的转录因子edeB基因的表达盒、表达载体、重组细胞。
[0008]本专利技术还提供所述的转录因子edeB基因编码的蛋白。
[0009]本专利技术也提供上述基因和蛋白在产伊短菌素中的应用、或在制备生防菌中的应用，例如制备作为茄科作物青枯病、枯萎病和疫病的生防菌中的应用。
[0010]本专利技术尤其提供一种遗传改良的伊短菌素高产短短芽孢杆菌，其在出发短短芽孢杆菌中敲除edeB基因，或降低edeB基因的表达，或降低所述edeB基因表达蛋白的活性。
[0011]优选地，通过基因编辑方法将所述edeB基因进行敲除获得。
[0012]具体地，所述edeB基因的编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者来自于短短芽孢杆菌且具有与其至少95%以上，优98%以上，更优选99%以上的同一性，仍具所述功能的基因。
[0013]更优选地，所述edeB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0014]本专利技术还提供所述的伊短菌素高产短短芽孢杆菌在产伊短菌素中的应用。
[0015]本专利技术也提供所述的伊短菌素高产短短芽孢杆菌在作为生防菌中的应用。优选地，作为茄科作物青枯病、枯萎病和疫病的生防菌中的应用。
[0016]本专利技术通过挖掘发现短短芽孢杆菌的转录因子edeB基因，其在edeines生物合成过程中起着正调控作用。过表达edeB基因可显著增加短短芽孢杆菌X23中edeines的产量。与野生型X23相比，edeB基因过表达可使edeines总产量增加92.27 %。可在制备生防菌等中有较大的应用价值。
[0017]附图说明
[0018]图1短短芽孢杆菌X23中edeines合成基因簇潜在途径特异性调控因子EdeB的挖掘及同源性比对。其中，A：edeines的化学结构；B：edeB基因的生信分析。黄色方框为edeB基因在edeines基因簇中的位置；利用NCBI
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CDD和Pfam数据库对EdeB进行保守结构域分析；C：EdeB蛋白的功能位点分析；D：EdeB与其他ParB家族蛋白的同源性比较。
[0019]图2 edeB缺失突变株和回补株的抑菌活性比较。其中，A：edeB基因敲除流程图；B：生长曲线比较C:抑菌能力比较；D：抑菌圈半径比较。
[0020]图3HPLC
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MS分析X23、X23 (ΔedeB )和X23 (ΔedeB ) (PAD
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Apr
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Px
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edeB)的edeines产量。其中，A：通过HPLC
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MS分析比较edeines产量，edeine A和edeine B的保留时间分别用虚线表示；B: edeine A和edeine B的质谱图，分子离子[ M + H ] +分别为755.444 m / z和797.465 m / z；C：发酵48 h后edeine A和edeine B的产量变化。
[0021]图4edeB基因敲除对edeA、edeQ和edeG基因转录水平的影响。
[0022]图5edeines启动子主要元件分析。
[0023]图6 EMSA分析蛋白EdeB与edeines合成基因簇间的结合能力。
[0024]图7发酵培养基中野生型X23和过表达株X23 (PAD
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Apr
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Px
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edeB)的edeines产量比较。其中，A：通过HPLC
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MS分析比较edeines产量，edeine A和edeine B的保留时间分别用虚线表示；B：发酵48 h后edeine A和edeine B的产量变化。
[0025]具体实施方式
[0026]下面通过具体实施例对本专利技术作进一步的说明，以期对本专利技术有更好的理解，但并不构成对本专利技术的限制。
[0027]本专利技术实施例用到的材料1、菌株与质粒本研究所用的菌株和质粒见表1。
[0028]表1菌株和质粒
2、培养基和抗生素大肠杆菌E. coli和短短芽孢杆菌B. brevis常规培养采用LB培养基（胰蛋白胨 10.0 g，酵母提取物 5.0 g，NaCl 1.0 g，水 1000 mL，pH 7.0 ~ 7.5，固体培养则额外添加1.3%的琼脂粉）。发酵培养采用NB培养基（胰蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 3.0 g,氯化钠 5.0 g，葡萄糖 10.0 g，水 1000 mL，pH 7.0 ~ 7.5）。抗生素使用浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种转录因子edeB基因，其特征在于，所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者来自于短短芽孢杆菌且具有与其至少95%以上，优98%以上，更优选99%以上的同一性，仍具所述功能的基因。2.含有如权利要求1所述的转录因子edeB基因的表达盒、表达载体、重组细胞。3.如权利要求1所述的转录因子edeB基因编码的蛋白。4.遗传改良的伊短菌素高产短短芽孢杆菌，其特征在于，其在出发短短芽孢杆菌中过表达edeB基因，或提高edeB基因的表达，或提高所述edeB基因表达蛋白的活性。5.如权利要求4所述的伊短菌素高产短短芽孢杆菌，其特征在于，通过基因重组方法将所述edeB基因进行过表达获得。6.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜杰，刘清术，陈武，龙青山，郭照辉，黄彬彬，陈海荣，邬理洋，唐冰璇，
申请(专利权)人：湖南省微生物研究院，
类型：发明
国别省市：