一种利用稳定氢同位素比值质谱技术检测葡萄酒中甜菜酒精的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用稳定氢同位素比值质谱技术检测葡萄酒中甜菜酒精的方法，属于食品真实性领域的稳定同位素应用技术发明专利技术。包括以下步骤：(1)用稳定同位素比值质谱仪测定乙醇转化的乙酸甲基位点的氢同位素比值；(2)确定葡萄酒和甜菜酒精转化乙酸甲基位点的氢同位素比值的分布范围；(3)测定待测样品转化的乙酸甲基位点的氢同位素比值；(4)对比待测样品转化的乙酸甲基位点的氢同位素比值测定结果和葡萄酒的分布范围，若待测样品测定结果+6

【技术实现步骤摘要】
一种利用稳定氢同位素比值质谱技术检测葡萄酒中甜菜酒精的方法

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[0001]本专利技术涉及利用稳定同位素比值质谱仪测定化合物中特定位点的稳定同位素比值，并以此检测葡萄酒中甜菜酒精的方法，属于食品真实性领域的稳定同位素应用技术。

技术介绍
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[0002]根据国家标准GB 15037
‑
2006《葡萄酒》的规定，葡萄酒是以新鲜葡萄或葡萄汁为原料经全部或部分发酵而成的含有一定酒精度的发酵酒。三分工艺，七分原料，好的原料才会产出质量上乘的葡萄酒，这是葡萄酒行业的共识。因此，除特殊产品外，葡萄酒中不允许添加食用酒精，也不允许加糖发酵。然而在逐利思想下，一些不法企业会通过掺入酒精或加入糖、糖浆发酵来提高产量、降低成本，这侵犯了消费者权益，对正规厂商也造成了不公平竞争，影响葡萄酒行业的发展。
[0003]葡萄酒安全、质量与真实性技术是打击葡萄酒掺假造假的有效手段，是确保GB 15037被贯彻施行的关键措施。稳定碳同位素技术能够检测葡萄酒中是否掺入碳
‑
4植物糖(包括甘蔗糖、高果玉米糖浆)及其转化的酒精，国际葡萄与葡萄酒组织(OIV)和我国均制定了葡萄酒中乙醇碳同位素的分析方法标准，但由于碳同位素技术仅能检测出不同光合作用类型的糖类及其代谢物，而甜菜与葡萄的光合作用途径相同，因此碳同位素技术无法检测掺有甜菜酒精的葡萄酒或掺有甜菜糖的葡萄汁。
[0004]1981年，法国的Martin等人开发了点特异性分馏
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核磁共振(SNIF
‑
NMR)技术检测葡萄酒乙醇中甲基位点上的D/H的方法，根据D/H的差异检测葡萄酒中的甜菜酒精成分。该方法已被欧盟技术委员会(CEN)和国际葡萄与葡萄酒组织(OIV)采纳为官方方法标准，并且欧盟自1991年起开始以此标准为基础建立葡萄酒D/H数据库。但是，该方法存在两大技术难点：
①
需要通过特定微蒸馏系统从发酵液中分离提取高纯度乙醇，馏分中乙醇浓度应大于95％v/v且回收率高于96.5％，考虑到乙醇和水的互溶性特点，该微蒸馏系统需要特别定制；
②
使用核磁共振仪测定乙醇甲基位点的D/H，其原理是测定定量样品中甲基位点的氘的绝对含量，然而由于自然状态下氘的含量仅占氢原子的0.02％，因此为得到足够的信噪比和稳定性，单一样品的测定时间长达5h以上。由于上述微蒸馏系统为法国Eurofins公司的专利产品，单套价格需160万人民币，并且样品蒸馏时间需要4h以上，因此，尽管早已有方法标准，但近年来，全球范围内能够熟练使用该方法并得到准确数据的实验室寥寥无几，我国至今尚无一单位能够运用该技术，这严重妨碍了我国在葡萄酒掺假检测领域的研究和应用。
[0005]在上述背景下，本专利技术开发了稳定氢同位素比值质谱技术，使用相对低成本的稳定同位素比值质谱仪测定乙醇甲基位点的氢同位素比值，并以此为基础检测葡萄酒中的甜菜酒精。该专利技术操作简单、分析快速且成本低廉，适合大批量样品的分析测试。

技术实现思路
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[0006](1)拟解决的问题
[0007]针对检测葡萄酒中甜菜酒精需配套SNIF
‑
NMR的技术难题，提供一种简单、高效、低成本的解决方案，为葡萄酒真实性鉴别技术提供有效的分析手段。
[0008](2)本专利技术的具体方案
[0009]使用稳定同位素比值质谱仪测定乙醇中甲基位点氢同位素比值，分别确定真实葡萄酒样品和甜菜酒精乙醇甲基位点氢同位素比值的分布范围，将待测样品的乙醇中甲基位点氢同位素比值与分布范围对比进而得出结论。
[0010]具体实施步骤如下：
[0011]A)取一批真实葡萄酒、甜菜酒精和待检样品；
[0012]B)将样品稀释至乙醇浓度约3～5g/L，加入醋酸杆菌培养液后通入氧气，在密封条件下30℃发酵转化乙醇为乙酸；
[0013]C)向样品中加入氢氧化钙，反复震荡后取上清液进行冷冻干燥，取固体粉末待用；
[0014]D)向固体粉末中加入pH＝1的硫酸溶液，再用无水丙酮稀释至乙酸含量8g/L左右。
[0015]E)用气相色谱
‑
裂解
‑
稳定同位素比值质谱测定乙酸的氢同位素比值(δ2H值)；
[0016]F)用甲基位点δ2H
甲基
值已知的乙酸标准物质(或工作标准样品)进行数据校正，校正后的结果即为乙醇甲基位点氢同位素比值；
[0017]G)确定真实葡萄酒和甜菜酒精转换的乙酸甲基位点δ2H值的分布范围，即乙醇甲基位点上的δ2H值分布范围。
[0018]H)将待测样品的上述δ2H值与真实葡萄酒的分布范围对比，若待测样品的“δ2H值+6
‰”
小于分布范围的最小值，则可判定待测样品中含有甜菜酒精，反之则不含。
[0019](3)有益效果：
[0020]本专利技术建立了一种利用稳定氢同位素比值质谱技术检测葡萄酒中甜菜酒精的方法，方法操作简单、分析快速、成本低廉，适宜于葡萄酒中甜菜酒精的检测，有利于稳定同位素比值质谱技术和氢同位素技术在葡萄酒掺假检测领域的研究与应用。
具体实施方式：
[0021]下面通过具体的实施方案叙述本专利技术。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。
[0022]实施例一：
[0023]真实葡萄酒样品乙醇甲基位点氢同位素比值分布范围确定
[0024]1)取30个不同来源的真实葡萄酒和3个甜菜酒精；
[0025]2)将上述33个样品分别稀释至乙醇浓度约3g/L；
[0026]3)向500mL试剂瓶中50mL稀释后的样品，各加入2.5mL醋酸杆菌培养液，充入氧气后密
[0027]封，并在30℃恒温条件下震荡直至发酵终止；
[0028]4)选择三个乙酸工作标准物质，其甲基位点稳定氢同位素比值(δ2H)
[0029]分别为
‑
223.93
‰
、
[0030]5)
‑
61.02
‰
和141.65
‰
，用纯净水将各乙酸工作标准物质配制成乙酸含量约3％的水溶液；
[0031]6)发酵后的样品和稀释后的乙酸工作标准物质水溶液各取25mL，加入1g氢氧化钙后涡旋震荡2h，然后8000rpm离心30min，取上清液保存待用；
[0032]7)将上清液至于冷冻干燥机中冻干，保留粉末待用；
[0033]8)向样品粉末中加入15mL硫酸溶液(1moL/L)，硫酸溶液中水的δ2H
[0034]为
‑
88.51
‰
，涡旋
[0035]震荡1h；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用稳定氢同位素比值质谱技术检测葡萄酒中甜菜酒精的方法，包括如下步骤：1)分别将真实葡萄酒、甜菜酒精和待检样品的乙醇转化成乙酸；2)用稳定同位素比值质谱仪测定乙醇转化的乙酸甲基位点的氢同位素比值；3)分别确定葡萄酒和甜菜酒精转化乙酸甲基位点的氢同位素比值的分布范围；4)将待检样品转化乙酸甲基位点的氢同位素比值与4)中葡萄酒数据范围对比，若该值+6
‰
小于数据范围的最小值则可认定葡萄酒中有甜菜酒精。2.根据权利要求1所述的一种利用稳定氢同位素比值质谱技术检测葡萄酒中甜菜酒精的方法，其特征在于使用稳定同位素比值质谱仪测定乙醇甲基位点的稳定氢同位素比值，可以配套使用高温裂解/元素分析仪，也可以配套使用气相色谱
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高温裂解系统，优选配套气相色谱
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高温裂解系统。3.根据权利要求1所述的一种利用稳定氢同位素比值质谱技术检测葡萄酒中甜菜酒精的方法，其特征在于，步骤1)中将乙醇转变成乙酸时可以采用微生物发酵法，也可采用乙醇氧化法，优选密闭条件下的微生物发酵法。4.根据权利要求1所述的一种利用稳定氢同位素比值质谱技术检测葡萄酒中甜菜酒精的方法，其特征在于，步骤2)中要用稳定同位素比值质谱仪测定乙醇转化...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟其顶，王道兵，武竹英，岳红卫，张洛琪，
申请(专利权)人：中轻技术创新中心有限公司，
类型：发明
国别省市：