识别糖肽中唾液酸的糖苷键的方法技术

从前体XIC的峰计算样品的唾液酸糖肽的一种或多种同分异构体中的同分异构体的分离时间。使用第一组和第二组的XIC，对分离时间处的第一组的产物离子强度求和从而产生第一和，并对分离时间处的第二组的产物离子强度求和从而产生第二和。计算第一和与第二和的比率。将分离时间处的比率与预定比率范围进行比较，每个预定比率范围对应于一次或多次从第一键和第二键的集合中进行的选择的组合。从在比较中发现与该比率匹配的组合中识别同分异构体的唾液酸与聚糖的一个或多个键。唾液酸与聚糖的一个或多个键。唾液酸与聚糖的一个或多个键。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】识别糖肽中唾液酸的糖苷键的方法
[0001]相关申请
[0002]本申请要求于2020年7月8日提交的美国临时专利申请序列号63/049,157的权益，其内容通过引用全部并入本文。


[0003]本文的教导涉及操作串联质谱仪的电子捕获解离(ECD)装置以识别糖肽的一个或多个唾液酸键。更具体地，本文的教导涉及用于使用具有2
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5eV的电子能量的ECD和多反应监测(MRM)前体离子到产物离子转变来识别糖肽的同分异构体的唾液酸与聚糖的一个或多个键的系统和方法。本文公开的系统和方法可以与处理器、控制器、微控制器或计算机系统(诸如图1的计算机系统)结合执行。

技术介绍

[0004]唾液酸键背景
[0005]已知唾液酸复合糖在多种病理生理过程中发挥关键作用，包括病毒感染、胚胎发生、炎症、心血管疾病、癌症和神经发育。最常见的哺乳动物唾液酸包含N
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乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的不同键。这些键包括Neu5Ac
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alpha(2,6)半乳糖(Gal)(以下称“α2,6”)和Neu5Ac
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alpha(2,3)Gal(以下称“α2,3”)。确定α2,6和α2,3的相对丰度对于诊断刚刚描述的病理生理过程很重要。
[0006]α2,6和α2,3的N
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聚糖或N
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糖肽中的立体化学结构识别通常被报道为通过诸如毛细管电泳(CE)和离子迁移率(IMS)等分离技术进行。不幸的是，没有报道过通过常规蛋白质组学鸟枪法样品制备的非衍生糖肽的液相色谱耦合质谱分析(LC
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MS)的任何方法。使用LC
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MS和鸟枪法样品制备(非衍生糖肽)降低了实验复杂性并提高了整体样品通量。相反，生化识别在MS之前采用聚糖的键特异性唾液酸衍生化。换句话说，这些技术通常需要在质谱分析(MS)之前将聚糖化学地转化为衍生物。
[0007]例如，Reiding等人的“通过采用键特异性唾液酸酯化的MALDI
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TOF
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MS对蛋白质N
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糖基化的高通量分析”(以下简称为“Reiding论文”)描述了一种用于唾液酸稳定化和基质辅助激光解吸/电离(MALDI)飞行时间(TOF)质谱分析(MS)的方法以研究糖基化。Reiding论文在乙醇中结合使用羧酸活化剂，以实现α2,6唾液酸的近乎完全乙酯化和α2,3变体的内酯化。换句话说，Reiding论文描述了聚糖在MS之前的乙酯化化学转化。
[0008]类似地，Zhao等人的“碰撞活化解离和电子捕获解离为支链全甲基化寡糖提供互补结构信息”(以下简称“Zhao论文”)描述了一种用于确认聚糖的序列、支链和键分配的方法。Zhao论文不涉及确定α2,6和α2,3键。然而，Zhao论文确实描述了使聚糖经历全甲基化以增加它们对碰撞活化解离(CAD)和电子捕获解离(ECD)的敏感性。换句话说，Zhao论文描述了聚糖在MS之前的全甲基化化学转化。对于这些聚糖，CAD和“热”ECD提供了互补结构信息。
[0009]因此，需要使用通过常规蛋白质组学鸟枪法样品制备的非衍生糖肽的LC
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MS或LC
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MS/MS来确定糖肽的唾液酸键α2,6和α2,3的丰度的系统和方法。
[0010]质谱分析技术背景
[0011]质谱仪通常与色谱或其他分离系统(诸如离子迁移率)耦合，以便从样品中识别和表征感兴趣的洗脱已知化合物。在这样的耦合系统中，洗脱溶剂被电离，并以被称为保留时间的特定的时间间隔从洗脱溶剂中获得一系列质谱。这些保留时间的范围从例如1秒到100分钟或更长。在保留时间测得的质谱的一系列离子强度形成色谱图，或提取离子色谱图(XIC)。
[0012]在XIC中发现的峰用于识别或表征样品中的已知肽或化合物。更具体地，峰的保留时间和/或峰的面积用于识别或表征(量化)样品中的已知肽或化合物。
[0013]在传统的分离耦合质谱系统中，选择已知化合物的片段或产物离子进行分析。然后在分离的每个间隔针对包括产物离子的质量范围执行串联质谱或质谱/质谱(MS/MS)扫描。在每次MS/MS扫描中发现的产物离子的强度会随着时间的推移而被收集，并作为例如谱集或XIC进行分析。
[0014]通常，串联质谱或MS/MS是用于分析化合物的众所周知的技术。串联质谱涉及对来自样品的一种或多种化合物的电离、对一种或多种化合物的一种或多种前体离子的选择、将一种或多种前体离子碎裂成片段或产物离子，以及对产物离子的质量分析。
[0015]串联质谱可以提供定性信息和定量信息二者。产物离子谱可用于识别感兴趣的分子。一种或多种产物离子的强度可用于定量样品中存在的化合物的量。
[0016]可以使用串联质谱仪执行大量不同类型的实验方法或工作流程。这些工作流程的三大类是靶向采集、信息依赖采集(IDA)或数据依赖采集(DDA)、和数据独立采集(DIA)。
[0017]在靶向采集方法中，为感兴趣的化合物预定义前体离子到产物离子的一个或多个转变。当样品被引入串联质谱仪时，在多个时间段或循环中的每个时间段或循环期间询问或监测该一个或多个转变。换言之，质谱仪选择并碎裂每个转变的前体离子，并仅对该转变的产物离子执行靶向质量分析。结果，为每个转变产生强度(产物离子强度)。靶向采集方法包括但不限于多反应监测(MRM)和选择反应监测(SRM)。
[0018]对基于三重四极的仪器的多反应监测(MRM)是所有应用领域中靶向MS量化的标准质谱技术选择，因为它能够为复杂混合物中特定成分的检测提供最高的特异性和灵敏度。然而，当今精确的质量MS系统的速度和灵敏度已经使具有类似性能特征的新定量策略成为可能。在此策略(称为MRM
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HR工作流程或并行反应监测，PRM)中，以高分辨率和短积聚时间收集环形MS/MS谱，然后在采集后提取片段离子以生成类似MRM的峰以进行积分和量化。借助像系统这样的仪器，这种靶向技术非常灵敏且速度足够快，能够实现与较高端三重四极仪器类似的定量性能，并能以高分辨率和高质量准确度测量完整的碎裂数据。
[0019]在IDA方法中，用户可以指定用于执行产物离子的非靶向质量分析的标准，同时将样品引入串联质谱仪。例如，在IDA方法中，执行前体离子或质谱分析(MS)调查扫描以生成前体离子峰列表。用户可以选择标准来过滤峰列表得到峰列表上的前体离子子集。然后对前体离子子集中的每种前体离子执行MS/MS。为每种前体离子产生产物离子谱。当样品被引入串联质谱仪时，对前体离子子集的前体离子重复执行MS/MS。
[0020]然而，在蛋白质组学和许多其他样品类型中，化合物的复杂性和动态范围非常大。这对传统的靶向方法和IDA方法提出了挑战，需要非常高速的MS/MS采集来深入询问样品，
以便识别和量化广泛的分析物。
[0021]因此，开发了第三大类串联质谱法，DIA方法。这些DIA方法已被用于提高从复本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于使用电子捕获解离(ECD)和多反应监测(MRM)前体离子到产物离子转变来识别糖肽的同分异构体的唾液酸(SA)与聚糖的一个或多个键的系统，所述系统包括：分离装置，所述分离装置从样品中分离糖肽的一种或多种同分异构体；离子源，所述离子源将所分离的一种或多种同分异构体电离，从而产生包括糖肽的前体离子的同分异构体离子的离子束；串联质谱仪，对于多个分离时间中的每个分离时间，所述串联质谱仪使用具有2
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5eV电子的ECD装置对所述离子束执行第一组一个或多个MRM转变和第二组一个或多个MRM转变，从而产生所述前体离子的提取离子色谱图(XIC)以及所述第一组和所述第二组的每种产物离子的XIC，所述第一组一个或多个MRM转变中的每个转变包括所述前体离子和已知对于糖肽的SA与糖肽的聚糖的第一键被增强或抑制的产物离子，所述第二组一个或多个MRM转变中的每个转变包括所述前体离子和已知对于SA与聚糖的第二键被增强或抑制的产物离子；以及处理器，所述处理器与串联质谱仪通信并执行以下操作：a.从TIC的峰计算所分离的一种或多种同分异构体中的同分异构体的分离时间，b.使用所述第一组和所述第二组的XIC，对分离时间处的所述第一组的产物离子强度求和从而产生第一和，并且对分离时间处的所述第二组的产物离子强度求和从而产生第二和，c.计算所述第一和与所述第二和的比率，d.将分离时间处的所述比率与预定比率范围进行比较，每个预定比率范围对应于一次或多次从所述第一键和所述第二键的集合中进行的选择的组合，其中一次或多次对应于已知包括在糖肽中的一个或多个SA，以及e.从在所述比较中发现与所述比率匹配的组合中识别同分异构体的SA与聚糖的一个或多个键。2.根据权利要求1所述的系统，其中，SA包含N
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乙酰神经氨酸(Neu5Ac)。3.根据权利要求2所述的系统，其中，聚糖包括半乳糖(Gal)。4.根据权利要求3所述的系统，其中，所述第一键包括Neu5Ac
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alpha(2,6)与Gal(α2,6)，并且所述第二键包括Neu5Ac
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alpha(2,3)与Gal(α2,3)。5.根据权利要求1所述的系统，其中，SA包括N
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羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)。6.根据权利要求2所述的系统，其中，聚糖包括甘露糖(Man)。7.根据权利要求1所述的系统，其中，所述串联质谱仪使用具有3eV电子的ECD装置碎裂第一组转变和第二组转变的前体离子。8.根据权利要求1所述的系统，其中，所述第一组包括一个或多个MRM转变，所述一个或多个MRM转变包括676.5m/z的产物离子。9.根据权利要求1所述的系统，其中，所述第一组包括一个或多个MRM转变，所述一个或多个MRM转变包括676.5、677.5和678.5m/z的产物离子。10.根据权利要求1所述的系统，其中，所述第一组包括一个或多个MRM转变，所述一个或多个MRM转变包括838.3、839.3和840.3m/z的产物离子。11.根据权利要求1所述的系统，其中，所述第一组包括一个或多个MRM转变，所述一个或多个MRM转变包括676.5、677.5、678.5、838.3、839.3和840.3m/z的产物离子。
12.根据权利要求1所述的系统，其中，所述第二组包括一个或多个MRM转变，所述一个或多个MRM转变包括292.1m/z的产物离子。13.根据权利要求1所述的系统，其中，所述第二组包括一个或多个MRM转变，所述一个或多个MRM转变包括292.1、293.1和294.1m/z的产物离子。14.根据权利要求1所述的系统，其中，所述第二组包括一个或多个MRM转变，所述一个或多个MRM转变包括274.1、275.1和276.1m/z的产物离子。15.根据权利要求1所述的系统，其中，所述第二组包括一个或多个MRM转变，所述一个或多个MRM转变包括274.1、275.1、276.1、292.1、293.1和294.1m/z的产物离子。16.根据权利要求1所述的系统，其中，在步骤b中，所述处理器使用所述第一组和所述第二组的XIC，对分离时间处的所述第一组的产物离子强度的移动平均值求和从而产生所述第一和，并且对分离时间处的所述第二组的产物离子强度的移动平均值求和从而产生所述第二和。17.根据权利要求1所述的系统，其中所述处理器还从前体的XIC的第二峰计算所分离的一种或多种同分异构体中的第二同分异构体的分离时间，并且针对第二同分异构体执行步骤b
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e以识别第二同分异构体的SA与聚糖的一个或多个键。18.根据权利要求9...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘苏亚，马场崇，
申请(专利权)人：DH科技发展私人贸易有限公司，
类型：发明
国别省市：