一种菌藻共生球总RNA的提取方法技术

一种菌藻共生球总RNA的提取方法，包括以下步骤：将菌藻共生球置于无菌预冷研钵中，加入菌藻共生球质量的1～3倍的石英砂和液氮(使菌藻共生球全部浸没在液氮中)后，迅速充分研磨得到细胞匀浆，离心后收集细胞匀浆上清液，用于后续总RNA提取；所述菌藻共生球为霉菌与微藻共生培养形成。本发明专利技术通过加入石英砂结合液氮对菌藻共生球进行速冻研磨，代替了单纯的液氮研磨或石英砂研磨，使得RNA提取时对菌藻共生球的需求量大大降低，显著缩短了研磨耗时。该方法还有利于将菌藻共生球研磨成粉末，提高菌藻共生球研磨后细胞匀浆与RNA isolater提取剂的充分接触，进而减少总RNA提取物中细胞外膜多糖和蛋白质的残留量，提高菌藻共生球总RNA的提取浓度和质量。藻共生球总RNA的提取浓度和质量。藻共生球总RNA的提取浓度和质量。

【技术实现步骤摘要】
一种菌藻共生球总RNA的提取方法


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，尤其是涉及一种菌藻共生球总RNA的提取方法。

技术介绍

[0002]微藻是自然界分布最广的微生物，它们可以在压力大的环境条件下生长，例如如在重金属污染、高盐度、营养胁迫和极端温度，微藻的细胞壁富含以多糖为主的细胞外聚合物(EPS)，蛋白质和核酸，可以与带电金属离子、重金属和有机污染物结合，微藻具有良好的生物吸附潜力。
[0003]从悬浮液中收获藻类的方法有多种，如离心法、重力沉淀法、自然加压过滤法、化学絮凝法、电絮凝法和真空过滤法等。然而，这些方法效率低，能耗高，不适合大规模工业化回收微藻，且微藻细胞体积小(直径<30um)和细胞间静电斥力等不良特性，显著地限制了微藻实现大规模商业化生产的经济可行性和可持续性。
[0004]真菌能形成球状去吸附培养液中的微藻形成真菌
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微藻共生菌丝球，其菌丝可以用作固定化微藻的载体材料，有利于从培养基中将球团过滤分离出来进而降低了微藻采收过程的运营成本，丝状真菌与微藻互利共生还能提高了微藻的生物量并降低培养成本，和微藻形成真菌
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微藻共生系统。因此，将藻类与丝状真菌共培养成为了一种高效收获微藻的新方法。
[0005]目前，真菌
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微藻共生菌丝球在微藻采收和重金属处理方面有显著优势，但关于解析转录水平的分子机制尚未有详细报道，其中之一的问题在于：丝状真菌菌体层层加厚，常见的液氮研磨无法快速、充分地将真菌
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>微藻共生菌丝球分散成粉末，且，传统的SDS法和CTAB法无法大量提取RNA，容易因残留的多糖、糖蛋白而影响提取后总RNA的纯度，进而导致共生菌丝球总RNA提取的效率和质量均偏低，同时直接影响到转录组测序结果的准确性。但是目前关于共生菌丝球总RNA的提取并没有一种广泛认可且有效的方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种操作简单，安全、有效、快速且污染少的菌藻共生球总RNA的提取方法。
[0007]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
[0008]一种菌藻共生球总RNA的提取方法，包括以下步骤：
[0009]1)细胞匀浆处理：将菌藻共生球置于无菌预冷研钵中，加入菌藻共生球质量的1～3倍的石英砂和液氮(使菌藻共生球全部浸没在液氮中)后，迅速充分研磨得到细胞匀浆，离心后收集细胞匀浆上清液，备用；所述菌藻共生球为霉菌与微藻共生培养形成；
[0010]2)将步骤1)得到的细胞匀浆上清液转入离心管，按每5～10
×
106个细胞加入1mL RNA isolater，静置5～10min；待样品完全融化后，再继续吹打至裂解液透明；
[0011]3)将裂解液转移至离心管中，12000
×
g、4℃离心5min，吸取裂解液上清；由于菌藻共生球经石英砂和液氮研磨后，匀浆样品中含有较多蛋白、多糖等成分，离心去除包括真菌
细胞外膜多糖、高分子量DNA等杂质组成的沉淀，通过收集裂解液上清进而对菌藻共生球的总RNA进行初步富集。
[0012]4)向步骤3)的裂解液上清中加入500～700μl的氯仿/异戊醇，涡旋混合后，4℃静置10min以上；12000
×
g、4℃离心10min，使裂解液中的含有RNA的水相和有机相高效分开，RNA在管底或管侧壁上形成胶状沉淀，去除上清液，
[0013]5)加入至少1mL 75％乙醇洗涤步骤4)离心后的沉淀，轻弹管底，让沉淀悬浮起来，并上下颠倒8～15次，室温静置3
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5min后，12000
×
g 4℃离心5min，弃去上清；
[0014]6)在洁净的环境中室温敞口干燥沉淀2
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5min，加入适量的RNase
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free ddH2O溶解沉淀，必要时可用移液器轻轻吹打几下、混匀，待完全溶解后即可得到总RNA，取少量检测，其余在
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85～
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65℃保存备用。
[0015]本专利技术的菌藻共生球总RNA的提取方法，通过采用石英砂和液氮一起研磨菌藻共生球，不仅加大对真菌和微藻细胞壁的破坏力度，提高总RNA的提取效率，同时，大大降低了总RNA提取对菌藻共生球原料的需求量和研磨时间；且有利于将菌藻共生球研磨成粉末，提高菌藻共生球研磨后细胞匀浆与RNA isolater提取剂的充分接触，进而减少总RNA提取物中细胞外膜多糖和蛋白质的残留量，提高菌藻共生球总RNA的质量。
[0016]本专利技术首次将RNA isolater用于菌藻共生球中两种共生微生物RNA的分离提取，利用了RNA isolater的强裂解能力，加大对真菌的细胞壁和细胞质的破坏，并保护菌藻共生球总RNA的完整性。
[0017]所述菌藻共生球为霉菌与集胞藻、聚球藻、小球藻、蓝丝菌任一一种微藻共生培养形成的菌藻共生球。
[0018]所述菌藻共生球为烟曲霉或青霉与集胞藻Synechcystis sp.PCC6803共生培养形成的菌藻共生球。优选，将100mL集胞藻Synechcystis sp.PCC6803(浓度为1～2
×
108个/mL)与培养48h后直径为3
‑
5mm的菌丝球(100个)混合后，置于30摄氏度150rpm的摇床中共生培养。
[0019]烟曲霉(Aspergillusfumigatus)，为实验室分离筛选得到的烟曲霉，筛选样本源自广东省阳江市阳东区东平镇柳溪重金属废水水样，丝状真菌烟曲霉经过含有印染废水平板筛选获得。先将采集的废水样(200uL)分别涂布至含有印染废水的固体平板上，将平板放入30℃恒温培养箱中培养5
‑
7天，待长出单菌落后，再划线至新鲜的含有印染废水的PDA平板上，至少重复5次，最终获得单一的丝状真菌。提取丝状真菌的DNA送至测序，通过BLAST基因库将测序结果与NCBI数据库进行比较，使用MEGA6.06将菌株的测序结果用于构建系统发育树(如图1所示)，经菌种鉴定分别为：Aspergillus fumigatus，其核苷酸序列如SEQ NO.1所示。
[0020]接种4％的烟曲霉分生孢子菌悬液于100mL液体培养基(葡萄糖(15g)，KH2PO4(1.0g),Na2HPO
4 12H2O(2.9g),NH4(SO4)2(1.0g),MgSO4.7H2O(0.5g),NaC1(0.5g)，牛肉膏(1.0g)，蒸馏水1000mL)中，在30
°
℃150rpm/min的恒温摇床培养48h。集胞藻PCC6803，接种5％微藻菌悬液于100mL BG
‑
11培养基，在30℃，光暗比12:12h，光照强度为2000Lux的光照培养箱静置培养，每天手动摇瓶2次，防止贴壁生长。再将培养48h后形成的真菌菌丝球从液体培养基中过滤分离，用生理本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种菌藻共生球总RNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：将菌藻共生球置于无菌预冷研钵中，加入菌藻共生球质量的1～3倍的石英砂和液氮(使菌藻共生球全部浸没在液氮中)后，迅速充分研磨得到细胞匀浆，离心后收集细胞匀浆上清液，用于后续总RNA提取；所述菌藻共生球为霉菌与微藻共生培养形成。2.如权利要求1所述菌藻共生球总RNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：1)细胞匀浆处理：将菌藻共生球置于无菌预冷研钵中，加入菌藻共生球质量的1～3倍的石英砂和液氮(使菌藻共生球全部浸没在液氮中)后，迅速充分研磨得到细胞匀浆，离心后收集细胞匀浆上清液，备用；2)将步骤1)得到的细胞匀浆上清液转入离心管，按每5～10
×
106个细胞加入1mL RNA isolater，静置5～10min；待样品完全融化后，再继续吹打至裂解液透明；3)将裂解液转移至离心管中，离心，吸取裂解液上清；4)向步骤3)的裂解液上清中加入500～700μl的氯仿/异戊醇，涡旋混合后，4℃静置10min以上，离心，去除上清液，5)加入至少1mL 75％乙醇洗涤步骤4)离心后的沉淀，并上下颠倒混匀，室温静置3
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5min后，离心，弃去上清；6)在洁净的环境中室温敞口干燥沉淀2
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5min，加入适量的RNase
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free ddH2O溶解沉淀，即可得到总RNA。3.如权利要求1所述菌藻共生球总RNA的提取方...

【专利技术属性】
技术研发人员：申丽，王俊俊，田庆华，曾伟民，成金菊，周豪，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：